化學發光免疫檢測在生化檢驗中的應用

＊馮 淼

（鄭州工業應用技術學院 河南 451100）

化學發光免疫檢測法為借助磁場分離抗體以及抗原的沉淀和游離部分，針對檢測目標進行定性及定量的一種檢測方式，在臨床上也可將其稱為化學發光標記免疫測定法，當前已經可以在心臟疾病、病毒標志物、臨床腫瘤、免疫系統疾病的診斷和治療當中廣泛應用[1]，特別是在針對甲狀腺疾病進行診斷時，檢測內容重點之一即為甲狀腺球蛋白濃度，但若僅采用常規的檢測方式，不僅假陰性和假陽性的檢出率較高，且難以為后續的臨床治療方案設計工作提供指導，所以有必要針對化學發光免疫檢測在生化檢驗中的應用進行深入分析。

1.化學發光免疫概述

化學發光免疫分析即為發光分析和免疫反應結合應用所構建起的微量抗原以及抗體新型標記免疫分析技術，其中經典的標記技術為熒光免疫技術、放射免疫技術、發光免疫技術、酶免疫技術，在原子中的電子或是分析吸收能量以后，電子或是原子可以由基態躍遷至激發態，之后再返回到基態中，并對光子進行釋放，技能呈現出發光的現象。其中的基本原理為針對抗原或是抗體標記化學發光物或酶標志物，其中產生免疫反應以后，將復合物置入到氧化劑或者化學發光劑中，使其發光，并對其發光強度進行檢測，同時計算待測濃度。一般來說，應使用有機化合物作為化學發光物，并借助氧化反應促使其發光[2]。

按照分子能量來源，可以將其劃分成為光照發光、生物發光以及化學發光，并且化學發光還可被劃分成為直接和間接兩個類型。在化學反應可以釋放充足的能量促使參與反應的物質進入到激發態時，如果被激發的對象為反應產物分子，則這一過程為直接化學發光，如果激發傳遞至另一未參加化學反應的分子D上，促使D分子進入到激發態，即為間接化學發光[3]。該方法自20世紀70年代開始應用于臨床，當時主要作為示蹤信號，但是因為靈敏度較差、發光時間較短，所以應用過程中限制較多。目前我國醫學相關技術快速發展，在辣根過氧化物酶標技術應用越來越廣泛的同時，化學發光免疫檢測技術的發光時間延長且信號強度提升，既往存在的不足之處已經得到顯著改善。

2.化學發光免疫檢測的應用價值

化學發光免疫檢測法屬于當代臨床生化檢驗工作中應用頻率較高的一類檢測方法，可以在病毒檢測、心臟病檢測等多個方面進行應用，具體情況如下：

（1）腫瘤標志物的檢測：機體組織及細胞內均存在蛋白質、酶、激素等多種腫瘤標志物，針對其進行檢測，可以為患者的早期診斷以及預后水平的監測提供重要依據，例如，檢測鱗狀細胞癌抗原以及細胞角蛋白19的可溶性片段（cy-fra21-1）濃度即可為食管癌進行診斷和觀察病情變化，且應用效果較好。

（2）心臟疾病的檢測：心臟病的發生與發展均與肌紅蛋白以及心肌損傷標志物之間具有密切關聯性，所以可以針對二者進行檢測，可以準確診斷心臟疾病患者，并能夠對其臨床癥狀變化情況進行準確、及時的監測。

（3）乙肝病毒標志物檢測：既往針對乙型病毒性肝炎患者，主要使用ELISA法進行定性檢測，但是無法滿足臨床上的定量要求，而當前進行病毒感染情況判斷時，可以選擇將乙肝表面抗原（HBsAg）作為主要標志物，以能夠同時滿足定性和定量的要求，并且相應的靈敏度、特異性和準確性較高[4]。

（4）梅毒螺旋體檢測：針對患者機體內的非密螺旋體特異性抗體進行檢測，之后還需進行一次確證檢測，將兩次檢測結果結合應用方可確診，臨床上實際檢測梅毒螺旋體的過程中，如果采用人工檢測的方式，不僅效率較低，且操作過程復雜，無法滿足多項臨床要求，而在其中使用化學發光免疫檢測法，可以應用全自動分析儀，有效降低其中的假陽性率，也就可以提升臨床診斷結果的準確性。

3.化學發光免疫檢測在生化檢驗中的應用

(1)快速化學發光免疫分析方法

若采用傳統的免疫分析方法，不僅需要耗時數個小時，且在溫育過程中，免疫試劑極易吸附于管壁上，并導致不同類型的測定信號之間發生交叉，接著能夠使樣品檢測通量受到限制，同時免疫分析方法的實際使用效果也能受到影響。此時可以采用外場驅動的方式或是有效混合溶液的方式，促使抗體、抗原等不同的生物大分子提升傳質速率，或是促使反應體系溫度提升，以強化免疫反應的動力學，也就可以實現免疫檢測效率的提升[5]。

在實際應用快速化學發光免疫分析方法的過程中，可以選擇使用超聲波驅動、改變電滲流、電磁攪拌、電場驅動等多種方式提升傳質速率，特別是采用磁場富集與電場驅動相結合的方式構建起微流控器件，并將一定的電壓施加于流通池內，促使包含電荷的待測物逐漸移向微陣列表面，且在進行溫育時，因為分子探針中含有磁珠，所以可以借助磁鐵將其富集于微陣列表面，整體上來看，實現了雙重加速，且整個過程耗時最多3min。

在進行外力驅動過程中，需要借助附加設備實現加速，例如在進行免疫反應時，借助附加設備將氮氣勻速通入到其中并形成微氣泡，可以縮短溫育時間約50%，并且微氣泡加速免疫反應措施的成本低廉、過程簡潔，分析流程整體僅需耗時16min，如圖1所示[6]。

圖1 微氣泡加速化學發光免疫分析法示意圖

(2)電化學發光免疫分析方法

電化學發光技術（ECLI）為最近幾年受到重視的一項先進技術，可在物質分析工作中作為痕量分析手段，當前已經能夠在臨床疾病診療或是基礎醫學研究中得到廣泛應用，發展前景良好。目前ECLI的主要生產廠家為瑞士羅氏公司，其中的ROCHE/2010型電化學發光分析系統不僅功能齊全，且操作便捷、分析靈活、穩定性良好，同時分析速度較快，十分適合在臨床實驗中應用。

從實際上來看，電化學發光免疫分析的過程包含電化學以及化學發光兩個部分。先由電啟動發光反應，以針對反應實施精準的控制，使用[Ru(bpy)3]2+作為標記物，標記物生物分子及配體發生具有特異性的結合反應之后，共同進入到流動測量室當中，電發光過程同時被啟動。這一過程主要可以分為以下幾個部分：①含有三丙胺（TPA）緩沖液進入測量室，電極針對其加電；②發光劑[Ru(bpy)3]2+以及電子供體TPA各在陽極表面失去一個電子，并且失去時間相同；③二價[Ru(bpy)3]2+經過氧化成為三價，TPA經過氧化成為TPA+，因為陽離子自由基穩定性嚴重不足，所以自發失去質子并轉變成為自由基TPA，其還原性較強，能夠對外釋放電子三價標記物，接收電子后可形成激態Ru2+，在熒光機制的影響之下發生衰減，后續可發出光子，光子波長為620mm，并再次形成基態Ru。后續只要出現加電現象，電極表面即能持續產生光子，Ru濃度與光強度之間具有線形關系[7]。

將該方法應用于甲狀腺腫瘤檢測工作中，甲狀腺蛋白以甲狀腺球蛋白為主要表達形式，占蛋白總量的75%左右，可作為甲狀腺激素生物合成的基礎。并且，受到蛋白水解酶的影響，甲狀腺激素可以脫離TG，之后釋放至血液當中。在通常情況下，循環血中含有微量甲狀腺球蛋白，甲狀腺疾病患者、特別是甲狀腺腫瘤患者，其血液甲狀腺球蛋白濃度相對較高，甲狀腺球蛋白的半衰期通常在4～60h之間。所以，應用化學發光免疫檢測法時患者的甲狀腺球蛋白個數以及甲狀腺球蛋白水平明顯高于放射免疫分析法檢測，同時檢測結果的靈敏度、特異性、準確率均較高，所以甲狀腺腫瘤患者有必要定期檢查甲狀腺球蛋白個數以及甲狀腺球蛋白水平，以及時根據其實際情況調整治療方案[8]。

(3)多組分化學發光免疫分析方法

將多組分檢測的方式應用于單個分析流程之中，能夠呈現出所需時間段、分析通量高以及樣品消耗少等優勢，且相對其他模式來說，分析成本也相對更低。多組分化學發光免疫分析中主要包含兩種不同的檢測模式，一種是多組分同時檢測模式，另一種是順序檢測模式，前者可與陣列檢測器或是空間分辨技術進行結合，從而同時針對數個待測物開展檢測工作，后者則可在移動固定的時間之內針對不同的組分進行逐一的檢測。根據最近幾年的情況來看，目前在多組分免疫分析中應用頻率較高的多組分化學發光免疫分析方法為安培免疫傳感器陣列，該方法同時將多通道電化學工作站和電極陣列作為基礎，大幅度推動了多組分化學發光免疫分析方法的發展，如圖2所示[9]。

圖2 通道底物二維分辨化學發光多組分免疫分析方法

例如，在應用底物區帶分辨化學發光多組分免疫傳感系統的過程中，可以應用單個分析流程針對癌胚抗原（CEA）以及癌胚抗原125（CA125）兩種腫瘤標志物進行檢測，將二者的捕獲抗體固定在經過醛基活化處理的UltraBind膜上，形成免疫反應器之后，將樣品、ALP標記CEA抗體、HRP標記CA125抗體共同注入免疫體反應器開展在線溫育工作，經過夾心免疫反應后，將ALP以及HRP的化學發光底物區帶逐一通入，即可同時針對二者進行檢測。

4.結束語

進行生化檢驗工作的過程中，可以滿足疾病標記需求的抗原類型較少，所以應該積極優化生化檢驗方法的應用情況，也就需要注重完善以下幾項重點：

（1）進一步提升檢驗結果的靈敏度及準確性，延長檢驗下限，提升分析結果放大倍數，以不斷拓展化學發光免疫檢測法的實用性及應用范圍。

（2）優化化學發光免疫檢測相關的儀器設備，促使其進一步實現小型化和智能化，以能夠在整體上提升化學發光免疫檢測法的靈敏度、特異性和準確性，從而在各類疾病的診療工作中發揮更加重要的作用。