骨質疏松差異miRNA表達及靶基因分析

楊一秋 解繼勝

(右江民族醫學院 1研究生學院,廣西 百色 533000;2基礎醫學院組織胚胎學教研室)

骨質疏松是一種以骨量減少、骨微結構退化,骨骼脆性增加的疾病〔1〕,常好發于女性,尤其是50歲以上的女性。骨質流失是一個無聲的過程,沒有疾病的體征和癥狀。可能導致骨折、骨活動能力改變及功能下降,最終嚴重影響患者的生活質量〔2,3〕。通過雙能X線骨密度測定法(DEXA)測定骨密度,是診斷骨質疏松的“金標準”。1999年頒布的DVO指南中提供了診斷和治療絕經后骨質疏松、老年性骨質疏松和糖皮質激素誘發的骨質疏松的策略,指南中提到通過補充鈣和維生素D及雙磷酸鹽如阿侖磷酸鹽等來治療骨質疏松〔4〕,但是由于存在子宮內膜癌、乳腺癌、血栓栓塞性等多種副作用,目前還沒有安全有效的藥物來治療骨質疏松,提前預防才是解決問題的最佳方法。MiRNA是小的非編碼RNA,通過識別同源序列,干擾轉錄、翻譯或表觀遺傳過程來調節基因表達。MiRNA被Drosha酶剪切成初級miRNA(pri-miRNA)再進一步加工成前體miRNA(pre-miRNA),最后通過Dicer酶加工生成成熟miRNA〔5〕。多項研究表明miRNA在骨質疏松發生發展過程中發揮重要作用〔6～9〕。生物信息學及基因芯片分析技術已經廣泛應用于篩查基因組、轉錄組等水平的變化。本研究擬通過生物信息學方法篩選出骨質疏松中差異表達的miRNA,并查找分析關鍵靶基因的功能和作用,以期為骨質疏松的診斷及發病機制提供依據。

1 材料和方法

1.1芯片信息 從GEO數據庫獲得骨質疏松與非骨質疏松基因芯片表達譜,兩個數據集分別是GSE91033和GSE74209,其中GSE91033包括1例正常對照組和2例骨質疏松患者的血清miRNA表達譜。GSE74209包括6例正常對照組和6例骨質疏松患者髖骨組織miRNA表達譜。

1.2篩選兩個數據集中差異miRNA 使用GEO數據庫中GEO2R在線分析工具,按調整后P<0.05,logFC>1或logFC<-1分別篩選兩個數據集中差異miRNA并通過SangerBox工具繪制差異miRNA火山圖。

1.3選取兩個數據集中均上調miRNA 使用TBtools軟件繪制GSE91033和GSE74209兩個數據集中均上調miRNA的韋恩圖。

1.4差異miRNA的靶基因預測 通過TargetScan在線預測兩個數據集中均上調miRNA的靶基因并通過FunRich軟件、DAVID在線數據庫對靶基因做GO、KEGG功能富集分析和轉錄因子預測。

1.5靶基因調控網絡圖 通過STRING在線工具繪制靶基因調控網絡圖,篩選條件為最高可信性(highest confidence)>0.9,然后通過Cytoscape軟件中的cytohubba插件按照Degree算法篩選出前20的基因。

1.6統計學分析 采用Wilcoxon檢驗分析。

2 結 果

2.1差異miRNA的篩選 通過分析這兩個數據集中差異miRNA的表達,結果顯示在GSE91033數據集中,與正常組對比,骨質疏松組外周血中差異miRNA有204個。其中有164個miRNA上調,40個miRNA下調。在GSE74209數據集中,與非骨折組相比,骨折組中有138個差異miRNA,其中有39個miRNA上調,99個miRNA下調。見圖1。

黑點為正常樣本與骨質疏松患者樣本中沒有差異表達的miRNA,紅點和綠點分別為骨質疏松患者樣本中上調和下調的miRNA圖1 兩個數據集中差異miRNA的火山圖

2.2兩個數據集中均上調miRNA的選取 分別將兩個數據集中上調和下調的miRNA做韋恩圖,發現兩個數據集中均上調的miRNA共有6個(分別為hsa-miR-3148、hsa-miR-4514、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-2467-3p、hsa-miR-1299、hsa-miR-5096)。兩個數據集中均下調的miRNA只有1個,數量太少不符合分析條件,故而選取在兩個數據集中均上調的miRNA作為研究對象。

2.3GO、KEGG功能富集分析與轉錄因子預測 通過TargetScan在線數據庫預測6個均上調的miRNA的靶基因,結果表明這些miRNA的靶基因共有353個,它們的GO生物過程包括三酰甘油合成過程、細胞分裂、細胞對DNA損傷刺激的反應、成纖維細胞遷徙的正向調控、骨重建等。KEGG富集分析得到缺氧誘導因子(HIF)-1信號通路、細胞外基質(ECM)受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調節、E-鈣黏蛋白(cadherin)信號通路等。通過FunRich軟件對靶基因的轉錄因子進行預測,根據其所調控的基因數與P值,選取富集程度最顯著的10個轉錄因子進行展示,包括:鋅指蛋白(ZFP)161、叉頭框蛋白(FOX)A1、肝細胞核因子(HNF)1A、胚胎干細胞基因(POU5F)1、同源盒基因(LHX)4、DBX1、NKX6-1、RORA、TCF3、FOX12。見表1、圖2。

表1 靶基因的KEGG富集分析

圖2 靶基因的GO富集分析

2.3構建靶基因網絡調控圖和Hub基因分析 通過STRING繪制蛋白質-蛋白質相互作用網絡(PPI),得到351個節點,116條邊。通過Cytohubba插件分析得到20個節點,其中處于樞紐地位的基因有3個,分別是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、著絲粒相關蛋白(DSN)1、UBE203。見圖3。

圖3 靶基因蛋白網絡調控圖及樞紐基因查找

3 討 論

本研究說明,hsa-miR-3148、hsa-miR-4514、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-2467-3p、hsa-miR-1299、hsa-miR-5096有可能參與了骨質疏松機制,有作為骨質疏松潛在分子診斷標志物的可能,同時,本研究預測并篩選出關鍵基因MAPK1、DSN1、UBE203。Yu等〔10〕通過GEO數據庫分析骨質疏松患者和健康個體中差異表達的基因有TP53、MAPK1、CASP3、CTNNB1、NOTCH1、CDK1等,并通過體內外實驗驗證在PPI中得分最高的P53基因,在骨質疏松患者和小鼠骨質疏松模型中均上調,這些發現表明P53可能在骨質疏松的發展中發揮核心作用。

骨骼是一個代謝非常活躍的器官,在整個生命過程中都會經歷不斷的重塑。骨重塑包括破骨細胞消化去除礦化骨,然后通過成骨細胞形成骨基質并礦化成骨細胞。骨重建有助于修復骨基質中的微損傷,防止舊骨的積累,通過調整骨結構以滿足不斷變化的機械需求〔11〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是缺氧反應的主要調節因子之一,在骨骼建模、重塑和體內平衡中起著重要作用。既往研究結果表明,HIF-1α通過激活MLO-Y2細胞中的Janus 激酶(JAK)3 / 信號轉導和轉錄激活因子(STAT)4通路來促進破骨細胞分化因子(RANKL)的表達,并在體外增強骨細胞介導的破骨細胞分化〔12〕。骨細胞是骨骼中數量最大、壽命最長的細胞類型,機械刺激可以誘導和調節各種細胞功能,如基因表達、蛋白質合成及細胞增殖和分化等。在骨組織中,骨細胞被認為是對機械刺激有反應的主要細胞類型,體內和體外研究表明骨細胞骨架、樹突狀突起、以整合素為基礎的局灶粘連、連接素為基礎的細胞間連接、初級纖毛、離子通道和細胞外基質是目前報道的骨細胞中主要的機械傳感器〔13〕。Perlecan是一種硫酸乙酰肝素多糖,可作為骨骼的機械傳感器,Perlecan缺乏會損害鈣信號傳導加上ECM-受體相互作用和黏著斑通路的改變,可能導致缺乏Perlecan小鼠的成骨減少和增加Schwartz-Jampel綜合征患者患骨質疏松的風險〔14〕。本研究靶基因預測到的轉錄因子有POU5F1、ZFP161、FOXA1、HNF1A、LHX4、DBX1、NKX6-1、RORA、TCF3、FOXJ2等。Su等〔15〕研究發現,白藜蘆醇是一種具有雌激素活性的天然化合物,對骨骼具有保護作用并在體內外模型中起到降低患乳腺癌的風險。Forkhead蛋白對于白藜蘆醇的這兩種作用必不可少,骨保護作用歸因于通過src激酶依賴性雌激素受體激活誘導骨形態發生蛋白2,而FOXA1是白藜蘆醇誘導的雌激素受體依賴性骨形態發生蛋白2的表達所必需的。

綜上,篩選出來的差異miRNA有可能作為骨質疏松潛在的生物標志物,有助于骨質疏松治療藥物的研究和開發,靶基因的識別為骨質疏松的診斷和治療提供了新的方向。C57BL/6雌性小鼠通過摘除雙側卵巢可以成功建立動物骨質疏松模型〔16〕,為本研究下一步體內體外驗證實驗提供了重要的參考依據。