米曲霉固態發酵鐵皮石斛葉工藝條件的優化

◎ 徐哲萱，楊海龍

（溫州大學 生命與環境科學學院，浙江 溫州 325035）

在微生物發酵過程中，微生物可能對植物源基質中的活性物質進行一系列氫化、去糖基化、脫脂等反應，從而實現對功能活性物質的轉化和利用[1]。真菌固態發酵常用來增加植物源材料的營養價值，如提高總酚、黃酮類化合物含量[2-3]，水分、溫度和發酵時間等發酵工藝參數直接影響著發酵產物中功能性成分含量及其生物活性[4-5]。梅玉立[6]在研究中發現，桑葉經最優發酵條件處理后生物堿含量和黃酮含量與發酵前相比分別增加了26.53%和29.56%，為桑葉活性成分的開發利用提供了參考。曹璐蕾[7]將由最優發酵工藝獲得的大豆加工副產物制作成飼料飼喂肉雞，增強了肉雞的免疫力。夏雨等[8]采用釀酒酵母等多種益生菌復合發酵苦蕎和鐵皮石斛葉兩種原料，以酒精度和總酸含量為指標，通過單因素試驗及正交試驗優化苦蕎石斛葉發酵酒的生產工藝，結果表明其最優發酵條件為發酵時間9 d，接種量1.5%，發酵溫度32 ℃，白砂糖添加量18%，在此條件下開發出了風味獨特、營養豐富的苦蕎石斛葉發酵酒 。因此，發酵工藝優化是一種最大化提升發酵效果的有效手段。

米曲霉是傳統發酵和食品加工中的重要菌種[9]，應用于醬油[10]、大豆醬[11]和白酒等傳統食品生產中[12]的歷史較為悠久。近些年，隨著人們健康意識的增強，研究者開始關注米曲霉發酵在提升發酵產物功能活性方面的應用，如抗氧化[13]、降血糖[14]等。研究表明，米曲霉在固態發酵過程中能產生多種水解酶，如纖維素酶和果膠酶等[15]，產生的酶可降解植物細胞壁從而促進有效成分的釋放，并可能對其中的成分進行生物轉化，提高其生物活性。本研究通過單因素試驗，確定初始含水率（v/w）、發酵溫度、發酵時間的適宜范圍，再以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標，設計響應面試驗獲得米曲霉發酵鐵皮石斛葉的最優條件，以期為高活性鐵皮石斛葉制劑的開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛葉，采收于浙江省樂清市綠豐鐵皮石斛種植專業合作社，55 ℃干燥后壓碎；米曲霉（Aspergillus oryzae）CGMCC 23295，溫州大學發酵工程研究室篩選，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。p-硝基苯酚葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、α-Glucosidase，購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

BT124S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-300VDV超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FW80粉碎機，江陰市保利科研儀器有限公司；HH-4A數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；TDL-80-2B低速離心機，上海優浦科學儀器有限公司；GXZ-260A光照培養箱，寧波市科技園區新江南儀器有限公司；Telstar LyoQuest-85冷凍干燥機，泰事達科技公司。

1.3 發酵方法

1.3.1 米曲霉菌種活化和種子制備

將保藏的米曲霉菌種接種于豆芽培養基（新鮮豆芽20 g蒸煮取汁、葡萄糖2 g、蛋白胨0.2 g、磷酸二氫鉀0.06 g、硫酸鎂0.03 g、瓊脂2 g、水100 mL），30 ℃培養3 d。活化后的菌種接種于液體豆芽培養基，30 ℃、160 r·min-1培養3 d制成種子液。

1.3.2 鐵皮石斛葉的固態發酵

稱取干燥鐵皮石斛葉碎片20 g置于三角瓶內，加入葡萄糖0.8 g，水20 mL，配制成固態發酵培養基，滅菌冷卻后按12.5%的接種量接入米曲霉種子液，攪拌均勻，置于30 ℃恒溫培養箱內培養。

1.3.3 發酵條件的優化

（1）單因素試驗。以鐵皮石斛葉醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性為考察指標，以初始含水率、發酵溫度、發酵時間為單因素變量進行試驗。發酵溫度固定在30 ℃，發酵時間固定在4 d，設置初始含水率為40%、50%、60%、70%、80%；初始含水率固定在70%，發酵時間固定在4 d，設置發酵溫度為22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃；初始含水率固定在70%，發酵溫度固定在30 ℃，設置發酵時間為2 d、4 d、6 d、8 d、10 d。

（2）響應面優化試驗。結合單因素試驗結果選擇初始含水率、發酵時間和發酵溫度的優化范圍，以鐵皮石斛葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性為響應值，優化鐵皮石斛葉發酵工藝參數。根據Box-Behnken試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析法進行試驗設計，各因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平表

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

發酵樣品取樣后進行冷凍干燥、粉碎、過40目篩。稱取干燥粉末0.5 g，加入80%乙醇25 mL，50 ℃超聲提取2 h。離心取上清液，真空條件下旋轉蒸發至干，然后加入7.5 mL二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，用于α-葡萄糖苷酶抑制活性分析。

α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參照FRANCO等[16]的試驗方法并稍進行修改。用磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH值為6.8）配制活性為2.419 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液和5 mmol·L-1的pNPG溶液。取PBS緩沖液3 mL、樣品溶液0.2 mL、α-葡萄糖苷酶液0.1 mL加入試管中，充分混勻，37 ℃孵育10 min后，加入PNPG 0.2 mL，充分混勻，37 ℃反應30 min后，加入0.2 mol·L-1Na2CO3溶液1 mL終止反應，然后在405 nm處測定吸光度，記為A1。相同條件下，用緩沖液代替酶溶液測定吸光值，記為A2，再取0.2 mL DMSO代替鐵皮石斛樣品測定吸光值，記為A3。抑制率按照公式抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%進行計算，以阿卡波糖（Acarbose，ACE）作為陽性對照并以阿卡波糖濃度為橫坐標，α-葡萄糖苷酶抑制率為縱坐標制作標準曲線，線性回歸方程為y=1 154x+1.736 8，R2=0.998 7，通過標準曲線將樣品的抑制率轉化成阿卡波糖當量，單位為mg ACE·g-1。

1.3.5 數據處理

單因素試驗數據采用GraphPad Prism 8.0進行統計處理。結果以平均值±標準差表示，統計分析采用方差分析(One-way ANOVA)、Tukey檢驗，P＜0.05為差異顯著。Design Expert 12用于響應面試驗設計和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養基初始含水率

水分對微生物的生長、生物轉化和代謝產物的產生及分泌具有重大影響[17]。培養基的含水率通常在30%～85%，較低的濃度會導致微生物產生孢子，而較高的濃度會限制氧氣供應并增加細菌污染的風險[18]。如圖1所示，隨著培養基中初始含水率的增加，米曲霉發酵鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性呈現出先增強后減弱的趨勢，最適初始含水率為70%，在此條件下，發酵樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性最強。

圖1 初始含水率對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.1.2 發酵溫度

溫度是真菌生長和次生代謝產物產生的至關重要因素之一[19]。米曲霉屬于中溫菌，在30 ℃左右的環境下生長最好，過高或過低的溫度均會對其產生抑制作用[20]。由圖2所示，當發酵溫度處于22～26 ℃時，發酵樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性較低。在培養過程中可以觀察到，相較于更高的溫度，米曲霉處于低溫時菌絲生長速度較為緩慢，表明較低的發酵溫度對米曲霉的生長代謝有抑制作用。當溫度達到30 ℃時，鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性達到最大值。隨著發酵溫度的升高，在34 ℃和38 ℃條件下，發酵過程初期米曲霉生長速度較快，但發酵后期可能由于溫度高，抑制了米曲霉生長，最終導致發酵樣品對酶抑制活性減弱。

圖2 發酵溫度對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.1.3 發酵時間

發酵時間是影響固態發酵的重要因素之一[21]。圖3展示了鐵皮石斛葉經米曲霉不同時間的發酵后對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。隨著發酵時間的延長，該指標呈現出先上升后下降的趨勢，在第2天后開始急劇上升，在第4天時達到峰值，此后逐漸下降。發酵初期，鐵皮石斛葉對α-葡萄糖苷酶抑制活性逐步提升，可能是由于微生物生長代謝活動旺盛，產生的一系列水解酶可以將植物細胞壁的纖維成分或者多酚、黃酮物質與其他物質之間結合的共價鍵破壞掉，促進這類物質的釋放和轉化[22]，活性成分含量增加，從而提高了發酵樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。發酵后期，微生物生長進入消亡期，加上底物中的營養物質被不斷消耗，導致發酵樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性下降。

圖3 發酵時間對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken試驗設計結果及方差分析

本試驗在前期米曲霉發酵鐵皮石斛葉單因素試驗基礎上，選取了各因素的優化范圍，進一步確定米曲霉發酵鐵皮石斛葉的最優發酵條件。試驗設計及結果見表2。利用Design Expert 12軟件，通過表2中葡萄糖苷酶抑制活性試驗數據進行多元回歸擬合，獲得鐵皮石斛葉酶抑制活性對編碼自變量初始含水率、發酵溫度和時間的二次多項回歸方程為

表2 Box-Behnken試驗方案及結果表

從該模型的方差分析（表3）可見，本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.406 9），表明模型是可靠的，未知因素對試驗結果的影響較小。通過數據分析獲得的模型決定系數R2為0.990 9，表明樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性的實測值與預測值之間具有較好的擬合優度，可用于鐵皮石斛葉發酵條件優化的分析和預測。校正決定系數(R2adj=0.979 1)與預測決定系數（R2Pred=0.922 2）差值＜0.2，模型信噪比為25.1703＞4，表明該模型具有較好的相關性，可信度高，有良好的穩定性與足夠的分辨力。

表3 響應面回歸模型的方差分析結果表

由表3可知，因素B（發酵溫度）、因素C（發酵時間）、二次項A2、B2和C2的P＜0.05，表明這些都是模型的顯著項，都對米曲霉發酵鐵皮石斛葉樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性有顯著影響。根據F值，3種因素對發酵鐵皮石斛葉體外降血糖活性的影響大小依次為發酵時間（C）＞發酵溫度（B）＞初始含水率（A）。綜上可知，該模型可用于鐵皮石斛葉發酵條件優化試驗的理論預測。

2.2.2 響應面分析

基于回歸模型分析，通過各因素的兩兩相互作用，對米曲霉發酵鐵皮石斛葉降血糖能力進行3D響應面和等高線圖分析，建立三維模型圖，如圖4、圖5和圖6所示。響應面開口向下凹越明顯，曲面越陡，表示響應值對于因素的敏感性越高，因素間的交互作用越顯著，反之則交互作用不顯著；等高線圖的形狀差異代表各因素之間的相互作用的強度不同，等高線越接近圓形，相應的因素之間的相互作用越弱。相反，等高線圖越近似橢圓形，各因素之間的相互作用越強[23]。由圖4可知，等高線接近圓形，說明初始含水率與發酵溫度的交互作用不顯著，對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響不顯著。如圖5所示，在初始含水率為70%～80%和發酵時間為4～6 d的條件下，米曲霉發酵鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性更高。如圖6所示，當初始含水率不變時，隨著培養溫度的升高和發酵時間的延長，發酵鐵皮石斛葉體外降血糖活性先增強后減弱。通過3D響應面的曲面陡峭程度可以發現發酵時間對于發酵后鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性影響最為顯著。

圖4 初始含水率與發酵溫度的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

圖5 初始含水率與發酵時間的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

圖6 發酵溫度與發酵時間的交互作用對鐵皮石斛葉α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響圖

2.2.3 發酵最優工藝參數預測與模型驗證

應用Design-Expert 12軟件對二次多項式回歸方程進行分析，得到米曲霉發酵鐵皮石斛葉最優工藝為初始含水率71.90%，發酵溫度29.35 ℃，發酵時間4.40 d。在此條件下，預期的α-葡萄糖苷酶抑制活性為57.99 mg ACE·g-1。因考慮到實際操作情況，將其調整為初始含水率72%，發酵溫度29 ℃，發酵時間4 d。按照前述調整后的條件，開展5次平行驗證試驗，鐵皮石斛葉的α-葡萄糖苷酶抑制活性平均為（56.69±0.14）mg ACE·g-1，與理論預測值相比相對誤差為2.24%，表明該最優工藝參數可靠。

3 結論

α-葡萄糖苷酶的抑制是治療Ⅱ型糖尿病的策略之一，采用米曲霉CGMCC 23295固態發酵鐵皮石斛葉，可顯著提升其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，從而使其具有開發降血糖功能產品的潛力。米曲霉發酵鐵皮石斛葉的最佳發酵工藝參數為初始含水率72%，發酵溫度29 ℃，發酵時間4 d，鐵皮石斛葉的α-葡萄糖苷酶抑制活性達（56.69±0.14）mg ACE·g-1，較優化前的樣品提升了31.3%。