復合益生菌抗斑馬魚感染及對炎癥的抑制作用

◎ 郭亞娟，喻 勤，嚴建剛，高業成，李曉敏，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

益生菌對人體有多種健康作用，其作用機制有干擾潛在病原體、改善屏障功能、免疫調節等[1]。研究表明，大腸桿菌、陰道加德納氏菌和白色假絲酵母是導致陰道炎的主要病原菌[2-3]，而益生菌在改善女性常見陰道感染方面具有顯著效果，口服益生菌具有降低陰道炎復發率的作用[4]，但這些實驗多在小鼠、人體上實施，試驗周期長、成本昂貴。而斑馬魚具有繁殖快、周期短等特點，且其胚胎和幼魚透明，轉基因魚的使用更有助于熒光顯微鏡對特定免疫細胞，如中性粒細胞進行體內可視化觀察[5]，已廣泛用于病原微生物感染模型的研究[6-7]。本文利用斑馬魚模型，研究嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001復合益生菌對常見陰道炎致病菌及炎癥的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型AB品系斑馬魚，自然交配繁殖。年齡為受精后4～5 d，用于腸腔分布試驗、對斑馬魚無可見有害作用水平的測定以及抗感染試驗；轉基因中性粒細胞綠色熒光MPX品系斑馬魚，自然交配繁殖，年齡為受精后4 d，用于改善炎癥功效試驗。用28 ℃養魚用水（每200 mg速溶海鹽用1 L反滲透水溶解，pH值為6.5～8.5，硬度為50～100 mg·L-1CaCO3，電導率為450～550 μS·cm-1）飼養斑馬魚，杭州環特生物科技股份有限公司養魚中心提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2012-0171，飼養管理符合國際AAALAC認證（認證編號：001458）的要求。

1.2 材料與試劑

萃妍益生菌固體飲料（主要成分為赤蘚糖醇、低聚果糖、嗜酸乳桿菌La-14、蔓越莓粉、透明質酸鈉、鼠李糖乳酪桿菌HN001）由完美（廣東）日用品有限公司提供，乳酸菌總數不低于1.0×1010CFU·g-1，用標準稀釋水配制濃度為200 mg·mL-1的母液，現配現用。

大腸桿菌（Escherichia coli）凍干菌種，編號為GDMCC 1.708=ATCC 35401，來源于廣東省微生物菌種保藏中心；白色假絲酵母（Candida albicans）凍干菌種，編號為GDMCC 2.194=ATCC 10231，來源于廣東省微生物菌種保藏中心；陰道加德納氏菌（Gardnerella vaginalis）凍干菌種，編號為GDMCC 1.1347=ATCC 14018，來源于廣東省微生物中心。

CM-DiI（紅色熒光）：批號2277732，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CM-DiI（綠色熒光）：批號2174897，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：批號70115000，中國Biosharp公司；二甲基亞砜（DMSO）：批號BCCD8942，瑞士Sigma公司；甲基纖維素：批號B2006074，中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器與設備

SZX7顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Vert.A1 CCD相機，上海土森視覺科技有限公司；AZ100電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡，日本Nikon公司；IM-300顯微注射儀，日本Narishige公司；PC-10拉針儀，日本Narishige公司；CP214精密電子天平，美國OHAUS公司；TD5A臺式大容量低速離心機，長沙英泰儀器有限公司；DensiCHEK Plus電子比濁儀，美國生物梅里埃公司；6孔板，無錫耐思生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 復合益生菌在斑馬魚腸腔分布實驗

隨機選取100尾受精后5 d的野生型AB品系斑馬魚置于培養皿中。用紅色熒光CM-DiI標記復合益生菌，并溶于養魚用水中，濃度為2 000 μg·mL-1，培養皿容量為30 mL，并于2 h、4 h、24 h分別隨機選取3尾斑馬魚，用熒光顯微鏡拍照。根據斑馬魚腸腔熒光情況，判斷復合益生菌是否活著到達其腸腔內。

1.4.2 復合益生菌抗斑馬魚感染實驗

參考付式杰等[8]方法并進行適當修改，具體操作方法如下。根據前期濃度摸索結果，復合益生菌對正常斑馬魚的無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）為1 000 μg·mL-1，以NOAEL劑量的1/4、1/2和1設定低、中、高劑量組，即復合益生菌質量濃度為250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1。

（1）抗大腸桿菌感染實驗。將受精后4 d的野生型AB品系斑馬魚置于6孔板中，每孔（實驗組）隨機放置30尾。將復合益生菌按照預設濃度溶解在養魚水中，模型對照組斑馬魚僅用養魚用水處理，每個孔體積為3 mL。28 ℃連續處理18 h后，各實驗組均注射用紅色熒光CM-Dil標記的大腸桿菌到斑馬魚腸腔內，換液繼續28 ℃處理3 h，建立斑馬魚大腸桿菌感染模型，根據斑馬魚腸腔是否有紅色熒光判斷造模是否成功。

（2）抗白色假絲酵母聯合陰道加德納氏菌感染實驗。將受精后4 d的野生型AB品系斑馬魚置于6孔板中，每孔（實驗組）隨機放置30尾。將復合益生菌按照預設濃度溶解在養魚水中，模型對照組斑馬魚僅用養魚用水處理，每個孔體積為3 mL。28 ℃連續處理18 h后，各實驗組均注射用紅色熒光CM-DiI標記的白色假絲酵母和綠色熒光CM-DiI標記的陰道加德納氏菌到斑馬魚腸腔內，并換液繼續28 ℃處理3 h，建立斑馬魚白色假絲酵母聯合陰道加德納氏菌感染模型，根據腸腔內是否有紅色熒光和綠色熒光判斷造模是否成功。

以上實驗結束后，每組隨機挑選10尾斑馬魚用熒光顯微鏡拍照，用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚腸腔內致病菌的熒光強度F以及抑菌率，用于評價復合益生菌抗感染功效。抑菌率計算公式為

1.4.3 復合益生菌改善斑馬魚炎癥實驗

參考付式杰等[8]方法并進行適當修改，具體操作方法如下。將受精后4 d的轉基因中性粒細胞綠色熒光MPX品系斑馬魚置于6孔板中，每組（正常對照組、模型對照組和低、中、高劑量組）隨機放置30尾，共150尾。將復合益生菌溶解在養魚水中，濃度與1.4.2復合益生菌抗斑馬魚感染實驗相同，正常對照組和模型對照組斑馬魚僅用養魚用水處理，每個孔體積為3 mL。28 ℃連續處理18 h后，除正常對照組外，其余各實驗組均注射大腸桿菌到斑馬魚腸腔內，建立斑馬魚炎癥感染模型，并換液繼續28 ℃處理3 h。實驗結束后，每組隨機挑選10尾斑馬魚用熒光顯微鏡拍照，用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚腸腔內中性粒細胞數量（N）和炎癥抑制率，用于評價復合益生菌炎癥抑制率。炎癥抑制率計算公式為

1.4.4 數據統計分析

各組實驗結果采用“均值±標準差”表示結果，使用SPSS 26.0軟件進行統計和單因素方差分析，各用Dunnett’s-t檢驗進行統計，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌在斑馬魚腸腔分布實驗

復合益生菌是一種活菌制劑[9]，所以評價其是否可活著到達腸腔就非常有必要。如圖1所示，斑馬魚經水溶給予CM-Dil紅色熒光標記的復合益生菌2 h、4 h和24 h后，其腸腔的熒光逐漸增強，說明2 h時，復合益生菌已經進入斑馬魚腸腔，4 h時腸腔已布滿益生菌，24 h時復合益生菌含量較4 h更明顯。從實驗結果可知，復合益生菌可活著到達斑馬魚腸腔，并在腸腔穩定存活。CHEN等[10]研究水溶給予斑馬魚乳雙歧桿菌實驗，同樣發現在水溶喂食2 h后，益生菌可進入腸腔，6 h、24 h可充滿整個腸腔，且可存活24 h以上，實驗結果與本實驗一致。

圖1 斑馬魚腸腔內復合益生菌熒光示意圖

2.2 復合益生菌抗斑馬魚感染作用

斑馬魚腸腔內大腸桿菌、白色假絲酵母、陰道加德納氏菌熒光情況見圖2，圖中實線輪廓是主要分析區域。用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析圖2并采集數據，分析復合益生菌對致病菌的抑菌率，具體結果見表1。由表1可知，與模型對照組相比，斑馬魚經水溶給予復合益生菌24 h后，致病菌的熒光強度均有所降低。復合益生菌對大腸桿菌、白色假絲酵母和陰道加德納氏菌均具有抑菌能力，其中對大腸桿菌的抑菌效果較好，250 μg·mL-1低濃度組已顯示抑菌作用，抑菌率為31.39%（P＜0.05），隨著濃度升高，抑菌率有升高趨勢，最高為35.56%（P＜0.01），但組間無統計學差異。然而，在白色假絲酵母聯合陰道加德納氏菌感染實驗中，只有高劑量組1 000 μg·mL-1具有抑菌作用，對白色假絲酵母菌、陰道加德納氏菌的抑菌率分別為33.34%（P＜0.05）、37.20%（P＜0.05），但總體抑菌率與對大腸桿菌的抑菌率接近。

表1 斑馬魚腸腔內致病菌熒光強度以及復合益生菌對致病菌的抑菌率結果表

圖2 斑馬魚腸腔內致病菌熒光強度典型圖

BERTUCCINI等[11]研究嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001在體外對陰道加德納氏菌、大腸桿菌的抑菌效果，結果顯示其有較強的抑菌作用，與本實驗結果相同，但體外研究結果顯示其對大腸桿菌的抑菌能力隨著濃度升高而增強，與本實驗結果有差異，可能是由于斑馬魚腸腔面積限制了復合益生菌的定植，待達到一定效果時，即使增加濃度也無法提高抑菌率。

2.3 復合益生菌改善斑馬魚炎癥作用

斑馬魚腸腔內中性粒細胞分布情況見圖3，圖中實線輪廓是主要分析區域。用NIS-Elements D 3.20高級圖像處理軟件分析并采集數據，分析斑馬魚腸腔內中性粒細胞數量，具體結果見表2。

表2 斑馬魚腸腔內中性粒細胞數量以及復合益生菌對斑馬魚腸腔炎癥抑制率結果表

圖3 斑馬魚腸腔內中性粒細胞熒光強度典型圖

中性粒細胞是一種多核白細胞，可通過多種機制消除病原體，在炎癥過程中將遷移并聚集在炎癥部位，是首先到達炎癥部位的白細胞，其數量變化可用來評估炎癥反應強弱[12]。由表2可知，正常對照組腸腔內中性粒細胞數量極顯著低于模型對照組（P＜0.001），說明建模成功，250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1組的炎癥抑制率分別為53.00%（P＜0.01）、81.00%（P＜0.001）、84.00%（P＜0.001），隨著濃度升高，炎癥抑制率有上升趨勢，但實驗組之間差異不顯著。這與復合益生菌抗大腸桿菌感染效果一致，推測其有可能是通過抗大腸桿菌感染達到抗炎功效。

3 結論

嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001復合益生菌具有較高的安全性，且可以活著到達斑馬魚腸腔，并發揮抗大腸桿菌感染、白色假絲酵母聯合陰道加德納氏菌感染作用以及改善大腸桿菌引起的炎癥，但具體機制仍需進一步研究。