LPY6緩解鎘對(duì)小麥毒害效應(yīng)的研究

夏影影，于燕燕，陶 均

（海南大學(xué) 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤的鎘（Cd）含量在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)呈急劇增加態(tài)勢(shì)[1-2]。由于鎘的不可降解性，土壤鎘污染已成為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)污染問(wèn)題，并威脅著人們的身體健康，急需高效的修復(fù)措施[3]。在土壤重金屬污染修復(fù)策略中，生物修復(fù)被廣泛關(guān)注。其中，微生物修復(fù)通過(guò)土壤中重金屬的吸附富集，溶解沉淀以及氧化還原等機(jī)理，降低或去除土壤中過(guò)量的重金屬[4]。不同的微生物可以通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)修復(fù)土壤鎘污染，如吸收和螯合[5]、胞內(nèi)積累[6]以及礦化[7]等。能修復(fù)鎘污染的微生物主要包括細(xì)菌、真菌與藻類。土壤細(xì)菌也可以通過(guò)改變土壤環(huán)境條件，產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)物質(zhì)等多種方式以提高土壤重金屬遷移率和生物利用度[8]。在高鎘的環(huán)境中，通過(guò)加入可高抗鎘并具有鎘吸附能力的細(xì)菌可修復(fù)土壤的鎘污染[9]。因此，獲得高抗鎘菌是利用細(xì)菌修復(fù)鎘污染土壤的前提。但大多已報(bào)道的抗性菌株并沒(méi)有表現(xiàn)出特別高的鎘抵抗能力[10-11]。此外，多數(shù)菌株只對(duì)少數(shù)重金屬具有抗性[10]，而土壤重金屬污染多為多金屬污染[12]，這導(dǎo)致細(xì)菌在重金屬環(huán)境中難以生存或繁殖，因此很難達(dá)到理想的修復(fù)效果。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期也從海南昌江礦區(qū)分離獲得抗鎘、銅、鋅、錳、鈷等多種重金屬的陰溝腸桿菌Cu6[13]，并通過(guò)馴化獲得了其他重金屬抗性未發(fā)生顯著變化而抗鎘能力顯著增強(qiáng)的菌株LPY6[14]。本研究以糧食作物小麥（Triticum aestivum）為植物材料，擬分析LPY6能否緩解鎘對(duì)小麥生長(zhǎng)的抑制作用以及可能的機(jī)制，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鎘污染修復(fù)工程菌提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株供試菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從海南昌江石碌礦區(qū)分離出的陰溝腸桿菌Cu6[13]以及馴化后得到的高抗鎘菌株LPY6[14]。

1.2 試劑鹽酸（HCl，優(yōu)級(jí)純）、硝酸（HNO3，優(yōu)級(jí)純）、水合氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鉛（PbSO4）和氯化錳（MnCl2）、過(guò)氧化氫（H2O2）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、三乙醇胺（TEA）和氯化鈣（CaCl2）。所使用試劑均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑公司。

1.3 培養(yǎng)基Luria-Bertani （LB）培養(yǎng)基（液體）：10 g Tryptone ，10 g NaCl ，5 g Yeast Extract，蒸餾水1 L。LB固體培養(yǎng)基： 液體LB+1.5%瓊脂。含金屬離子的LB培養(yǎng)基加相應(yīng)濃度的各種金屬。MS培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的粉末狀成品，使用時(shí)可以直接溶于超純水中，本實(shí)驗(yàn)使用1/4含量的MS液體培養(yǎng)基。

1.4 植株供試植株為小麥（T.aestivum），品種為‘銅麥6號(hào)’，購(gòu)于陜西大唐種業(yè)股份有限公司。

1.5 菌株LPY6對(duì)金屬抗性的測(cè)定細(xì)菌鎘最低抑制濃度（抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低鎘濃度）和最大耐受濃度（仍有部分細(xì)菌生長(zhǎng)的最大鎘濃度）的測(cè)定。Cd2+、Pb2+、Cu2+和Mn2+的質(zhì)量濃度均設(shè)置為0、300、500、1 000、2 000、3 000、5 000 mg·L-1，然后將LPY6菌株分別接種到含各濃度不同金屬的LB液體（30 ℃，180 r·min-1）和LB固體培養(yǎng)基（30 ℃）中，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察并記錄菌株生長(zhǎng)情況。

1.6 小麥種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)將濾紙放置在培養(yǎng)皿中，添加20 mL含不同濃度（0、50、100、200、300、500 mg·L-1）CdCl2·2.5H2O溶液到培養(yǎng)皿中，待濾紙完全浸濕后，選取較為飽滿且大小較一致的小麥種子放置于濾紙上（每皿放12粒）。蓋上蓋子，在光照培養(yǎng)箱里靜置3～5 d （28 ℃，16 h光照、8 h黑暗，80%濕度），以伸出種皮的胚根等于或長(zhǎng)于種子長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，確定計(jì)算種子發(fā)芽率。然后，以顯著抑制種子萌發(fā)的鎘濃度來(lái)處理種子，分析LPY6是否有緩解鎘對(duì)種子萌發(fā)的影響，設(shè)置4個(gè)處理（每處理3個(gè)重復(fù)）：CK（對(duì)照：1/4 MS培養(yǎng)基）、Cd、Cd+Cu6、Cd+LPY6（CdCl2·2.5H2O：500 mg·L-1，菌液濃度：OD600=0.1），進(jìn)行萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)（種子發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%）。

1.7 小麥盆栽實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)小麥種子在土壤中的耐鎘能力。采用營(yíng)養(yǎng)土與紅土混合土壤（V營(yíng)養(yǎng)土∶V紅土= 1∶2），干燥一段時(shí)間（室溫、通風(fēng)、30 d）待土壤平衡穩(wěn)定后，分裝至聚乙烯塑料盆（7 cm×7 cm×8 cm），每盆約110 g，設(shè)置土壤鎘含量為0、360、720、1 000、1 500、1 800、2 200、2 500 mg·kg-1，每處理3個(gè)重復(fù)。挑取顆粒飽滿小麥種子進(jìn)行育苗，4 d后移栽長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥幼苗于處理后的土壤中，每盆6棵（14 h光照、8 h黑暗，26 ℃）。每4天觀察記錄植物苗的生長(zhǎng)狀況，直至16 d。小麥生長(zhǎng)在含有不同鎘含量的土壤中。然后以此鎘含量（1 000、1 500 mg·kg-1）來(lái)分析LPY6是否有緩解鎘對(duì)小麥的毒害作用，設(shè)置9個(gè)處理（每處理3個(gè)重復(fù)）：鎘和細(xì)菌2個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平（鎘濃度：0、1 000、1 500 mg·kg-1；細(xì)菌：不加菌、加Cu6、加LPY6），完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。菌液終濃度OD600=0.1。觀察并統(tǒng)計(jì)小麥生長(zhǎng)狀況。

1.8 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.8.1 小麥生物量、生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定按步驟1.7處理，待小麥生長(zhǎng)至14 d后，小心分別取出各處理的小麥苗，將其根部沖洗干凈，然后擦拭干凈，進(jìn)行稱重、記錄鮮質(zhì)量。測(cè)量株高，根長(zhǎng)以及根毛數(shù)并記錄。然后將小麥苗整株放入65 ℃烘箱，3 d后取出（此時(shí)已完全烘干），記錄其干質(zhì)量。

1.8.2 小麥苗鎘含量測(cè)定采用原子吸收光譜法測(cè)定[15]。將上述烘干的小麥苗充分研磨粉碎，每個(gè)處理稱取0.1 g置于試管中，分別加入1 mL HNO3和0.5 mL的H2O2，設(shè)空白對(duì)照。用安東帕Multiwave 7 000 超級(jí)微波消解系統(tǒng)消解（海南大學(xué)分析測(cè)試中心）。消解樣品轉(zhuǎn)入15 mL離心管，分別加超純水定容至10 mL，使用原子吸收光譜儀（海南大學(xué)分析測(cè)試中心）測(cè)定鎘含量。

1.8.3 培養(yǎng)基中游離鎘濃度測(cè)定LPY6單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)（30 ℃，180 r·min-1），16 h后按1∶1 000（體積比）的比例轉(zhuǎn)接于新鮮預(yù)熱的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.8），制備OD600=2.0的菌懸液。以2 %的接種量將LPY6菌液接種到含不同質(zhì)量濃度鎘（0、150、250、500、1 250、1 500 mg·L-1）的液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，以不接菌空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每組處理3個(gè)重復(fù)，每隔12 h取菌液，菌液先測(cè)OD600值，然后進(jìn)行離心（10 000 r·min-1,5 min），使用原子吸收光譜儀對(duì)上清液中的鎘含量進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算LPY6菌降低游離鎘的能力：

式中：q為吸附率；C1為空白對(duì)照組上清液中鎘的濃度；C2菌處理組上清液中鎘的濃度；單位：mg·L-1。

1.8.4 土壤有效鎘含量測(cè)定采取DTPA作提取劑用原子吸收光譜法測(cè)定土壤中有效態(tài)鎘[15]。設(shè)置土壤鎘含量為0、360、720、1 000、1 500mg·kg-1。設(shè)置4個(gè)處理：CK（對(duì)照，不含鎘），只有鎘，鎘加Cu6，鎘加LPY6分別處理土壤。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。17 d后，將處理的土壤風(fēng)干后過(guò)篩（2 mm）。1 g土壤加入25 mL DTPA提取劑，放入培養(yǎng)箱（25 ℃，180 r·min-1）, 2 h后取樣，上清液過(guò)濾（0.22 μm）后，加1% HCl定容至10 mL，火焰法測(cè)得樣品的鎘含量。以DTPA為對(duì)照，土壤中有效態(tài)鎘含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w表示：

式中：C為鎘校準(zhǔn)曲線上查的質(zhì)量濃度（mg·L-1）；C0為空白對(duì)照濃度；V2為定容體積（mL）；V為樣品所使用的提取液體積；V1為提取液體積;m：為試樣質(zhì)量（g）。

1.9 數(shù)據(jù)分析采用 GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LPY6具有多種重金屬抗性鎘（CdCl2·2.5H2O）、銅（CuSO4）、鉛（PbSO4）和錳（MnCl2）的抗性實(shí)驗(yàn)表明，菌株LPY6對(duì)4種金屬均具有較強(qiáng)抗性(耐性)。LPY6對(duì) Cd2+的最小抑制質(zhì)量濃度為2 500 mg·L-1，Cu2+為400 mg·L-1，Mn2+為500 mg·L-1。LPY6對(duì)Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為3 000 mg·L-1，Cu2+為 450 mg·L-1，Mn2+為2 000 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度高于1 000 mg·L-1的含鉛培養(yǎng)液容易生成白色沉淀，所以無(wú)法確定Pb2+對(duì)LPY6的最小抑制濃度以及LPY6對(duì)Pb2+的最大耐受濃度，但菌株LPY6對(duì)鉛有較高抗性（＞1 000 mg·L-1）。

2.2 LPY6緩解鎘對(duì)小麥種子萌發(fā)的抑制作用

為分析LPY6是否具有緩解鎘污染的潛力，首先找出抑制小麥種子發(fā)芽的臨界CdCl2·2.5H2O質(zhì)量濃度為500 mg·L-1后，選用此濃度進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，小麥種子在無(wú)鎘條件下，其萌發(fā)率約為80%；單獨(dú)添加500 mg·L-1CdCl2·2.5H2O時(shí)，種子萌發(fā)率顯著被抑制；加鎘同時(shí)添加Cu6時(shí)，萌發(fā)率沒(méi)有明顯提高；但同時(shí)添加LPY6和鎘時(shí)，萌發(fā)率恢復(fù)到65%左右，只是萌發(fā)速度比對(duì)照要慢，結(jié)果說(shuō)明，LPY6具有一定的緩解鎘抑制小麥種子萌發(fā)的能力。

圖1 LPY6緩解鎘對(duì)小麥種子萌發(fā)的抑制作用

2.3 LPY6對(duì)鎘毒害小麥幼苗生長(zhǎng)的緩解作用

用盆栽實(shí)驗(yàn)來(lái)分析LPY6緩解鎘毒害小麥的作用。同萌發(fā)實(shí)驗(yàn)一樣，首先測(cè)定盆栽條件下顯著抑制小麥生長(zhǎng)（株高、葉長(zhǎng)和葉色）的土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1，導(dǎo)致小麥枯黃死亡的土壤鎘含量為1 500 mg·kg-1。因此選擇1 000和1 500 mg·kg-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，鎘處理土壤中小麥幼苗的生長(zhǎng)明顯受到抑制，LPY6緩解了鎘對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時(shí)，解毒效果較好，但Cu6沒(méi)有明顯降低鎘對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)抑制的作用（圖2-a）。當(dāng)土壤鎘含量為1 000和1 500 mg·kg-1時(shí)，LPY6對(duì)小麥的減毒效果如下：（1） LPY6增加了小麥株高（圖2-b），根長(zhǎng)（圖2-c）以及根毛數(shù)（圖2-d），且當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時(shí)，效果比較明顯。（2）LPY6明顯增加了小麥的鮮質(zhì)量（圖2-e）與干質(zhì)量（圖2-f），且在土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時(shí)效果較好。（3）LPY6降低了小麥幼苗的鎘含量（圖2-g），當(dāng)土壤鎘含量為1 000 mg·kg-1時(shí)，對(duì)小麥的減毒效果較好。

圖2 LPY6對(duì)鎘抑制小麥生長(zhǎng)的緩解作用

2.4 LPY6對(duì)培養(yǎng)基中游離Cd2+濃度的影響具重金屬抗性的微生物一般對(duì)此金屬有吸附能力，能夠通過(guò)細(xì)胞膜官能團(tuán)將重金屬離子吸附在細(xì)胞表面或通過(guò)一系列生命活動(dòng)將重金屬離子富集在細(xì)胞內(nèi)[16]。如圖3所示，具有高鎘抗性的LPY6能降低培養(yǎng)基中游離鎘的濃度。在含150 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對(duì)LPY6生長(zhǎng)抑制作用弱，LPY6生長(zhǎng)良好，在48 h時(shí)，LPY6生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至100 mg·L-1，降低率為33%（圖3 -a）。在含250 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，LPY6生長(zhǎng)依舊沒(méi)有受到顯著抑制，生長(zhǎng)良好；在48 h時(shí)，LPY6生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至180 mg·L-1，降低率為28%（圖3-b）。在含500 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對(duì)LPY6的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，在48 h時(shí)，LPY6生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)液中鎘含量降至385 mg·L-1，降低率為23%（圖3-c）。在含1 250 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對(duì)LPY6生長(zhǎng)有抑制作用，在36 h時(shí)OD值最大，培養(yǎng)液中鎘含量降低至633 mg·L-1，降低率為49%（圖3-d）。在含1 500 mg·L-1鎘的LB培養(yǎng)液中，鎘對(duì)LPY6的生長(zhǎng)抑制作用比較明顯，在36 h時(shí)OD值最大，培養(yǎng)液中鎘含量降低至930 mg·L-1，降低率為38%（圖3-e）。這說(shuō)明LPY6可以減少培養(yǎng)基中游離鎘的含量。

圖3 LPY6在含不同濃度鎘的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及對(duì)游離鎘濃度的影響

2.5 LPY6對(duì)土壤中有效鎘的影響小麥盆栽實(shí)驗(yàn)測(cè)定小麥種子在土壤中的耐鎘能力為1 000 mg·kg-1。因此筆者分析了土壤鎘含量為360 、720、1 000和1 500 mg·kg-1時(shí)LPY6對(duì)土壤中有效鎘的影響。如圖4所示，在以上鎘含量的土壤中，外施LPY6均可以使土壤中有效鎘含量減少，但Cu6幾乎沒(méi)有降低土壤有效鎘的能力。

圖4 LPY6對(duì)土壤中有效鎘的影響

3 討 論

本研究分析了LPY6在小麥上的作用，發(fā)現(xiàn)其具有緩解鎘對(duì)小麥萌發(fā)和生長(zhǎng)抑制作用的能力，不僅可以增加鎘環(huán)境中小麥的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，還能增加根長(zhǎng)和根的數(shù)目。更重要的是，LPY6能降低植物體內(nèi)鎘的含量，說(shuō)明LPY6具有直接或間接抑制鎘進(jìn)入植物體內(nèi)的作用。產(chǎn)生這種作用的原因可能是LPY6降低了土壤中可利用的鎘含量或降低了植物吸收鎘的能力。為此筆者分析了LPY6是否對(duì)其生存環(huán)境中自由鎘（可利用鎘）的含量有影響。在液體培養(yǎng)基中，LPY6能夠顯著降低游離鎘的濃度，表明其可能具有高效的鎘吸附、沉淀或吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。在土壤中，LPY6同樣可以顯著減少有效鎘的含量。這可能是LPY6緩解鎘毒害作用的原因。但LPY6是通過(guò)吸附、沉淀還是吸收作用來(lái)降低環(huán)境中有效鎘

的濃度還不清楚。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)LPY6有促進(jìn)明顯可見(jiàn)的沉淀形成的能力，通過(guò)沉淀作用來(lái)降低環(huán)境有效鎘濃度的可能性不大。在環(huán)境中溶液只有水時(shí)，菌株LPY6也能緩解鎘對(duì)小麥種子萌發(fā)的抑制作用。因此，LPY6也可能通過(guò)改變根際環(huán)境來(lái)降低植物吸收鎘的能力[17]。

綜上所述，菌株LPY6很有可能通過(guò)吸附或內(nèi)吸作用降低環(huán)境中可利用鎘的含量來(lái)緩解鎘對(duì)植物生長(zhǎng)的毒害作用，也可能通過(guò)改變植物根際環(huán)境來(lái)降低其鎘吸收能力，保護(hù)植物在高鎘環(huán)境中的生長(zhǎng)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。雖然LPY6離應(yīng)用還有很多問(wèn)題要解決，但是本研究發(fā)現(xiàn)其具有在土壤中緩解鎘對(duì)植物的毒害作用，表明其可能具有鎘污染修復(fù)的潛力，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效的修復(fù)工程菌奠定了基礎(chǔ)。