橡膠樹HbLFG2蛋白對植物免疫防衛的調控機理

聶雪純，李思鵬，劉玉涵，繆衛國，李 瀟

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228）

我國是天然橡膠消費大國。天然橡膠90%以上的產量都是產自于橡膠樹（Hevea brasiliensis）。該樹是重要的經濟作物，在我國云南、廣東和海南均有大面積種植，在東南亞和南美等地區也廣泛種植。在全球的植膠區，白粉病是危害橡膠樹較嚴重的一個病害[1]。橡膠樹白粉菌（Erysiphe quercicola）是橡膠樹白粉病的病原物，在分類上屬于子囊菌門白粉菌目（Erysiphes），白粉病發病初期在幼嫩組織以及葉表面會產生由菌絲產生的白色粉狀物，粉狀物下的葉片會有病斑出現。發病嚴重時會導致橡膠樹的花序和葉片畸形，葉片大量脫落[2]。每年橡膠樹白粉病都造成天然橡膠嚴重的損失[3]。對植物免疫系統的研究有助于人類利用該機制來對抗植物病害。植物免疫系統產生的防衛反應包括活性氧水平提高、胼胝質積累和超敏反應（一種植物組織上局部發生的細胞程序性死亡）等。這些防衛反應可被植物識別到病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）或病原效應子（effectors）而激發。目前，可激發植物防衛反應的病原因子有細菌鞭毛蛋白的flg22（flagellin domain of a synthetic 22-amino-acid peptide）、幾丁質（chitin）和卵菌激發素INF1等[4]。蛋白MLO（Mildew resistance locus o）在大麥（Hordeum vulgare）上被用作對抗白粉菌等子囊菌侵染的武器[5]。MLO基因被缺失突變后，大麥獲得了廣譜的白粉菌抗性，表明MLO是一類感病蛋白[5]。BI-1（BAX INHIBITOR-1）和LFG（LIFEGUARD）也被認為屬于感病蛋白，具有類似MLO的作用。敲除突變BI-1基因抑制了白粉菌的侵染，而過表達BI-1能加速侵染[6]。在哺乳動物和植物中，LFG蛋白也被稱為GAAP蛋白（Golgi antiapoptotic proteins），屬于BI-1蛋白亞家族，含有BI-1蛋白功能域。大麥和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中各含有5個LFG。已證明大麥的LFG蛋白HvLFGa和擬南芥的2個LFG蛋白AtLFG1和AtLFG2都參與了影響植物和白粉菌的互作，具有負調控植物抗白粉病的作用[7]。對于這些LFG蛋白編碼基因，過表達會促進白粉菌侵染，而沉默會抑制白粉菌侵染。BI-1具有抗細胞凋亡活性，而LFG和BI-1之間可能發生互作，具有協同抗凋亡活性[8]。AtLBI-1和AtLFG2在擬南芥中可發生共表達[7]，為此可以推測BI-1和LFG蛋白可能共同調節細胞死亡信號通路。

在橡膠樹中，前期已通過生物信息學方法，鑒定了2個LFG，包括HbLFG1和HbLFG2[9]。這2個LFG蛋白編碼基因HbLFG1和HbLFG2的轉錄水平在白粉菌侵染前期發生明顯上調，尤其HbLFG1上調更顯著，并且這2個LFG基因轉錄水平與病害發生程度呈正相關。在本氏煙草（Nicotiana benthamiana）表達HbLFG1可抑制疫霉激發子INF1和內質網脅迫藥劑DTT、TM誘導細胞壞死，但不能像BI-1一樣抑制細胞壞死誘導蛋白（Bax）誘導的細胞壞死[10]。在擬南芥Col-0表達HbLFG1可抑制幾丁質（chitin）和細菌flg22誘導的植物免疫反應，并促進橡膠樹白粉菌侵染擬南芥Col-0，而野生型的Col-0是不能被該菌侵染的[10]。以上結果表明，HbLFG1在橡膠樹中是潛在的感病蛋白，影響了植物免疫的激發水平，但是，目前對HbLFG2仍缺乏研究和了解。

本研究利用本氏煙瞬時轉染和擬南芥轉化系統，探究HbLFG2在植物免疫中的作用，以增加對感病蛋白影響橡膠樹白粉病抗性的認識，進一步了解橡膠樹LFG蛋白調控的植物免疫機制，為橡膠樹的抗白粉病育種和白粉病新農藥研發靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質粒實驗使用大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α來進行實驗載體的構建，使用根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101作為轉化介導體。載體pCAMBIA-35S-FLAG，攜帶INF1基因、Bax基因、pBIN空載體（可表達GFP基因）的根癌農桿菌均由筆者所在的實驗室提供；含pBIN空載體的擬南芥轉化子為實驗室原有植物材料。

1.1.2 實驗植物培養實驗中的植物為本氏煙草和Col-0野生型擬南芥。植物養育條件：溫度24 ℃，光照16 h/黑暗8 h。

1.1.3 試劑限制性內切酶BamHI（南京，Vazyme）; DNA片段回收試劑盒（上海，TaKaRa）；質粒小量提取試劑盒（美國，Omega）；RNA提取試劑盒（北京，Solarbio）。

1.1.4 自配試劑LB培養基：Tryptone 10 g·L-1、Yeast extract 5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1，調pH為7（制備固體培養基需要另外加入Agar 15 g·L-1）。0.5 g慶大霉素硫酸鹽，5 mL去離子水（已除菌），振蕩混勻制成慶大霉素溶液，將該溶液進行過濾除菌，儲存于-20 ℃。0.25 g卡那霉素，5 mL去離子水（已除菌），振蕩混勻制成卡那霉素溶液，將該溶液進行過濾除菌，儲存于-20 ℃。0.5 g利福平，5 mL DMSO（二甲基亞砜），振蕩混勻制成利福平溶液，將該溶液進行過濾除菌，遮光，儲存于-20 ℃中。擬南芥轉化懸浮液：蔗糖2.5 g、Silwet L-77 12.5 mL、ddH20 50 mL。脫色液：3∶1體積比例的無水乙醇和冰醋酸混液。苯胺藍染色液：0.1 g水溶性苯胺藍、0.1 mol·L-1K2HPO410 mL。DAB染液：吐溫-20 25 mL、NaHPO40.2 g、ddH2O 50 mL、DAB（diaminobezidin-3，3-二氨基聯苯胺） 0.05 g。20×10-6mol·L-1flg22：0.000 45 g flg22、10 mL ddH2O。

1.2 農桿菌介導的本氏煙草瞬時轉染轉化

1.2.1 HbLFG2基因的克隆，重組載體的構建以及DH5α轉化以橡膠樹總RNA為模板，用反轉錄試劑盒進行反轉錄合成橡膠樹的cDNA序列，并以此為模板，用引物對cDNA進行HbLFG2基因PCR擴增。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 ， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s（30個循環），4 ℃，冷卻10 min。將PCR擴增得到的DNA片段進行試劑盒回收，隨后，用BamHI將載體pCAMBIA-35S-FLAG切開，再將片段和切開的載體進行連接。37 ℃反應30 min，再將連接好的質粒進行大腸桿菌質粒轉化，涂板點板驗證菌落。最后用相同的引物對菌落進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳來驗證是否轉化成功。同理，使用同樣的方法，將煙草壞死實驗對照基因HbLFG1進行克隆和載體構建。本實驗所用的引物見表1。

表1 本實驗所用引物

1.2.2 農桿菌介導的本氏煙草瞬時轉染轉化

將含有HbLFG2-FLAG質粒的大腸桿菌進行擴增培養，用試劑盒提取質粒，進行GV3101農桿菌轉化，得到含有HbLFG2-FLAG質粒的農桿菌。把慶大霉素、卡那霉素、利福平這3種抗生素加到用于培養農桿菌的液體LB培養基中，備用。將含有目的基因的農桿菌，加入5 mL 的含3種抗生素的 LB 培養基進行擴增，將擴增的菌液轉到2 mL離心管中，4 700 r·min-1離心2 min，棄上清，用移 液槍取2 mL 0.01 mol·L-1氯化鎂對農桿菌進行吸打懸浮，4 700 r·min-1離心2 min，保留菌塊。再次懸浮農桿菌，稀釋菌液到OD600=0.6。向本氏煙的 葉片中注射稀釋后的農桿菌緩沖液，標記注射區域，遮光處理48 h，隨后進行蛋白表達驗證或進行形態觀察[10]。

1.2.3 蛋白提取和表達驗證將含有目的基因的農桿菌注射到煙草葉片上之后，用馬克筆對注射區域進行標記。遮光過后，剪下標記區域進行蛋白提取。將剪下的葉片組織用液氮進行研磨。研磨成粉后，加入到含有植物裂解液的1.5 mL離心管中，在30 min內對樣品進行多次振蕩混勻，隨后4 ℃，11 000 r·min-1離心5 min，將上清收集到新的離心管中，再次低溫離心，然后再次收集上清。將100 μL的植物蛋白上清加入蛋白上樣液20 μL，100 ℃處理10 min，此時的蛋白樣品可以進行SDS-PAGE凝膠電泳。將處理好的蛋白樣加入到SDS-PAGE凝膠電泳的膠孔中，電泳完成后切下蛋白膠，蛋白膠經過轉膜后，獲得含有目的蛋白條帶的PVDF膜。然后對該膜依次進行封閉牛奶，一抗，二抗處理。處理完成后用掃膜儀器進行掃描，觀察掃膜結果。

1.2.4 擬南芥轉化子制備將含有目的基因的農桿菌保菌液加到含3種抗性的LB培養基擴增。4 700 r·min-1離心10 min富集菌體。將富集好的菌體使用轉化懸浮液重懸，并稀釋到OD600=0.8。4周齡的擬南芥需要將果莢去除干凈，再將花浸泡在菌懸液處理20 s～30 s，隨后進行保濕遮光處理24 h。直至培養處理過的擬南芥長出葉片，待苗長出葉片后提取RNA，通過RT-PCR得到cDNA，再用引物進行轉化子的PCR驗證，標記PCR驗證結果為陽性的擬南芥轉化子植株。對轉化成功的擬南芥進行標記，等到其果莢成熟，獲得擬南芥轉化子T1代的種子。再將收集到的種子催化成苗，待苗長出葉片后提取RNA，再次進行引物驗證，并對驗證得到的擬南芥做標記，收集果莢成熟后的種子T2代。此時的擬南芥轉化子種子經過了2代的篩選，能穩定遺傳，可以開展相關實驗[10]。

1.2.5 胼胝質積累實驗苯胺藍熒光染料可標記病原菌PAMPs誘導而積累的胼胝質，使其在植物中能被清晰地觀察到。在本氏煙的實驗中，注射pbin-GFP、HbLFG2-FLAG農桿菌于葉片，標記好區域，遮光處理24 h，然后用20×10-6mol·L-1flg22處理葉片。flg22處理葉片36 h后，先用脫色液對對照及處理的葉片進行8 h脫色，接著用苯胺藍溶液染色8 h染色。把染好色的葉片放在熒光顯微鏡（OLYMPUS CX21，發射波長：461 nm）下觀察，選擇DAPI濾光片拍照。照片用 ImageJ軟件來測定胼胝質積累量。每個處理使用至少3片葉，并從每個葉片上隨機選取3個區域進行拍照，統計照片中每1 mm2面積胼胝質累積個數。在擬南芥的實驗中，先用20×10-6mol·L-1flg22處理4周齡的擬南芥植株葉片36 h[10]，然后用乙醇乙酸脫色液對擬南芥葉片進行脫色，再將擬南芥葉片放入苯胺藍溶液中進行8 h染色。熒光顯微鏡下觀察，選擇DAPI濾光片，拍照[11-12]。最后用ImageJ軟件測定胼胝質累積量。每個處理使用至少3片葉，并從每個葉片上隨機選取3個區域進行拍照，統計照片中1 mm2面積胼胝質累積個數。

1.2.6 ROS活性氧積累實驗DAB能與葉片中含有的過氧化氫反應，表現為棕色，觀察到的棕色小塊即積累的活性氧。用水和20×10-6mol·L-1flg22分別處理Col-0野生型擬南芥、GFP擬南芥轉化子和HbLFG2擬南芥轉化子的葉片表面36 h，2 d后取下葉片放于DAB溶液中避光處理10 h進行染色。配置乙醇乙酸脫色液，常溫脫色2 h，再對樣品進行拍照，用ImageJ 軟件計算照片中活性氧積累面積。樣本重復葉片數為9，統計照片中每片葉子活性氧面積占比。

1.2.7 植物細胞壞死實驗技術對4周齡的本氏煙葉片的表皮用注射器針頭劃出小傷后，用去除針頭的注射器在葉片傷口處注入農桿菌稀釋液或者藥液，遮光處理24～72 h，觀察葉片壞死情況并進行明場和紫外光下拍照。藥物DTT的共注射處理是在注射完農桿菌48 h后進行藥劑注射[10]。

1.2.8 數據處理采用軟件SPSS20.0對數據進行F檢驗，利用Excel對統計結果進行作圖[10-11]。

2 結果與分析

2.1 HbLFG2對植物免疫反應的影響western blot結果顯示，HbLFG2,GFP蛋白在煙草上均有表達（圖1-A）。之后，為測定HbLFG2是否能影響flg22誘導的植物免疫。用水和flg22分別處理空白對照煙草組織、表達綠色熒光蛋白（GFP）的組織和表達HbLFG2-FLAG的煙草組織。水處理組為陰性對照；flg22處理空白對照煙草組織和表達GFP的組織為陽性對照。結果（圖1-B,1-C）顯示，在陽性對照的葉片組織中出現大量的胼胝質積累，而HbLFG2-FLAG表達能顯著降低本氏煙上胼胝質積累量。說明HbLFG2能抑制煙草中flg22誘導的胼胝質產生。

圖1 在本氏煙草中，HbLFG2-FLAG對flg22誘導產生的胼胝質積累的影響

2.2 HbLFG2對植物防衛反應的影響圖2-A的結果顯示HbLFG2擬南芥轉化子T2代的基因組中存在HbLFG2，說明HbLFG2擬南芥轉化子制備成功。對野生型擬南芥、GFP擬南芥轉化子、HbLFG2-FLAG擬南芥轉化子進行水處理為陰性對照。flg22處理下，陽性對照Col-0擬南芥和GFP擬南芥轉化子的葉片激發出了大量胼胝質。在flg22處理下的HbLFG2-FLAG擬南芥轉化子葉片中則只有少量的胼胝質積累（圖2-B）。在flg22處理下的胼胝質積累量（圖2-C）表明，HbLFG2-FLAG擬南芥轉化子與Col-0擬南芥、GFP擬南芥轉化子存在顯著差異。這表明HbLFG2可抑制擬南芥中激發的胼胝質產生。

圖2 在擬南芥中，HbLFG2-FLAG對flg22誘導產生的胼胝質積累的影響

2.3 HbLFG2對植物防御反應的影響對Col-0野生型擬南芥、GFP擬南芥轉化子和驗證過的HbLFG2轉化子進行水處理為對照。經過活性氧染色可知，作為陰性對照的水處理，該處理下的野生型擬南芥、GFP轉化子和HbLFG2轉化子葉片有少量的活性氧積累。作為陽性對照的flg22處理下的未經過轉化的擬南芥和GFP轉化子葉片，有大面積的活性氧被激發，而flg22處理下，HbLFG2轉化子活性氧積累面積與前兩者相比較小（圖3-A）。由統計數據可知，在flg22處理組中，野生型擬南芥和GFP轉化子活性氧積累面積占比情況，與HbLFG2-FLAG轉化子相比存在顯著差異，這表明HbLFG2減弱了擬南芥中flg22誘導產生的活性氧積累（圖3-B）。

圖3 在擬南芥上，HbLFG2-FLAG對flg22誘導產生的活性氧積累的影響

2.4 HbLFG2基因對INF1,Bax,DTT所誘導的細胞壞死的影響疫霉激發素INF1，細胞壞死誘導蛋白Bax和內質網脅迫劑DTT能在植物上造成細胞程序性死亡[13-15]。在本氏煙草上，測試HbLFG2對這些因子誘導的細胞死亡是否具有抑制作用。

對HbLFG1，HbLFG2，GFP蛋白進行western blot表達驗證，發現HbLFG1，HbLFG2，GFP蛋白在煙草上發生了表達（圖4-A）。作為單獨注射對照，在煙草葉片上單獨注射表達INF1，Bax基因的農桿菌位點以及藥物DTT均發生了壞死，單獨注射表達GFP，HbLFG1，HbLFG2基因的農桿菌位點沒有發生壞死，說明對照處理正常（圖4-B，表2）。

圖4 在本氏煙中，HbLFG2基因對INF1,Bax,DTT所誘導的細胞壞死的影響

表2 壞死發生情況統計

在INF1的共注射實驗中，作為INF1的共注射對照，將含有GFP基因的農桿菌與含INF1基因的農桿菌共注射，注射位點均壞死，這說明載體并不會影響INF1誘導的細胞壞死；INF1與HbLFG1基因共表達時，發現HbLFG1能夠抑制INF1導致的細胞壞死，這與Li等[10]的報道結果相同。而HbLFG2與INF1基因共表達則不能抑制INF1誘導的細胞壞死（圖4-B，表2）。

在Bax的共注射實驗中，作為Bax的共注射對照，將含有空載pBIN載體的農桿菌與含Bax基因的農桿菌共注射，注射位點均壞死，說明載體并不會影響Bax誘導的細胞壞死；Bax與HbLFG1基因共表達時，發現HbLFG1不能夠抑制Bax導致的細胞壞死，與Li等[10]的報道結果一致；但HbLFG2與Bax基因共表達，細胞壞死受到抑制（圖4-B，表2）。

在藥物DTT的共注射實驗中，作為DTT的共注射對照，將含有空載pBIN載體的農桿菌間隔48 h后與藥物DTT共注射，注射位點均壞死，說明載體并不會影響DTT誘導的細胞壞死；DTT與HbLFG1基因共表達時，發現HbLFG1可以抑制DTT導致的細胞壞死這與Li等[10]的報道結果相吻合；但HbLFG2與藥物DTT共注射的位點壞死不受抑制（圖4-B，表2）。

3 討 論

橡膠樹中存在2個預測的LFG蛋白HbLFG1和HbLFG2，2021年文獻[10]報道，HbLFG1在本氏煙草和擬南芥的表達可以抑制植物的防衛反應和內質網脅迫引起的細胞死亡。在本研究中，HbLFG2表現出具有類似HbLFG1的功能，可以抑制植物的防衛反應，因此該蛋白可能促進植物的感病性，是潛在的感病蛋白。

類似HbLFG1[10]，在煙草或擬南芥中過表達HbLFG2可以抑制flg22激發的胼胝質，減少了活性氧的產生。植物感知flg22的是激酶類受體FLS2和BAK1[16]，并且flg22可以誘導植物中免疫信號分子水楊酸的積累[17]，胼胝質的積累發生在細胞壁，水楊酸能夠進一步誘導胼胝質的積累并增強活性氧爆發[12,18]。而擬南芥LFG/GAAP蛋白在內質網脅迫條件下可以抑制水楊酸產生[18]，植物BI-1也能抑制水楊酸誘導的細胞壞死[19]。據此，筆者推測HbLFG2或HbLFG1蛋白的積累可能干擾了flg22誘導的水楊酸途徑，從而產生抑制防衛反應的效果。

在植物中，Bax、DTT和INF1造成細胞壞死的原因不完全相同。Bax能引起活性氧積累，進一步引起細胞離子滲漏、細胞色素c釋放和脂質氧化反應[19]，DTT會造成過度的內質網脅迫[20]，而INF1會激活絲裂原蛋白激酶通路和誘導活性氧迸發[21]。植物BI-1可能主要通過降低改變細胞鈣離子流、抑制細胞色素c的釋放和脂質氧化反應來抑制細胞壞死[19]。植物BI-1定位于內質網，因此，還可能通過降低對內質網脅迫的敏感度來干擾Bax誘導的細胞壞死，鑒于細胞會在內質網脅迫條件下啟動自動死亡程序[22-23]。類似的，擬南芥LFG蛋白LFG1/GAAP1和LFG3/GAAP3也定位在內質網等細胞器，可以在內質網脅迫條件下抑制細胞壞死[23]，而且擬南芥LFG通過與內質網受體IRE1互作，負調控IRE1途徑來影響對內質網脅迫的敏感度，借此發揮調節細胞壞死的作用[24]。

本研究發現HbLFG2可以抑制Bax誘導的細胞壞死，但不能抑制DTT和INF1誘導的細胞壞死。相比之下，HbLFG1不能抑制Bax誘導的細胞壞死，卻能抑制DTT和INF1誘導的細胞壞死。這些結果表明2個橡膠樹LFG蛋白雖然都具有抑制植物細胞壞死的功能，但二者作用的方式不太相同。二者在功能上可能互相補充，共同調節植物免疫。