鹿血生物活性肽體外抗菌研究

◎ 付 慧，李紅瑩，高倩倩

(吉林農業(yè)科技學院食品工程學院，吉林 吉林 132000)

1 前言

生物活性肽是一類對動植物機體的生理活動有益的肽類化合物，被廣泛應用在食品及藥品等領域，其他領域還有待開發(fā)[1]。一直以來，在人的認知當中，鹿血都具有非常神奇的功效，它不僅可以益壽延年、活筋健骨、緩解疲勞，而且能夠提高機體免疫力，抵抗疾病入侵。微量元素、維生素是人體不可或缺的成分，而鹿血當中恰恰蘊含著豐富的對人體有益處的微量元素，如氨基酸、多肽、血紅蛋白等[2]。其中，血紅蛋白是大分子化合物，人體無法對其直接吸收利用，小分子的多肽則可以。鹿血制備的生物活性肽對人體有益的優(yōu)點有很多，比如可以降膽固醇和血壓、調節(jié)免疫力和腸道菌群，保護心腦血管，還具有抗氧化作用[3-4]。隨著科學技術的飛速發(fā)展，現如今，利用酶解技術可以將鹿血水解成小分子的生物活性肽，其具有抗炎抗菌、抗癌降壓、治療骨質疏松等功效[5]。

本試驗通過藥敏紙片法和MIC 法，測定鹿血生物活性肽抗菌效果，結果表明，生物活性肽對抑制菌群生長具有非常顯著的效果。因此，為充分挖掘生物活性肽的抑菌活性，對其進行深入性研究勢在必行。目前，我國研究生物活性肽的動物血液種類有很多，最為常見的是羊血和驢血。但是對鹿血中的生物活性肽的研究則少之又少，其體系也差強人意[6]。希望通過本次試驗，能夠突破對鹿血生物活性肽的研究，促進鹿血生物活性肽的進一步發(fā)展，以創(chuàng)造更多的市場。

2 材料和方法

2.1 試驗材料

鹿血生物活性肽純化液：前期研究成果；大腸桿菌與金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌：實驗室冰箱保存；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1 mo1/L Na0H 溶液、1 mo1/L HC1 溶液、胰蛋白胨、乳糖、K2HPO4、KH2PO4、三號膽鹽；硫酸紙、燒杯、乳糖膽管、三角瓶、吸量管、培養(yǎng)皿、玻璃棒、報紙、棉線、酒精燈、煮鍋、接種針、涂布棒、游標卡尺、麥氏比濁管、96 孔板。以上菌種、藥品及小件物品，均由食品工程學院微生物實驗室提供。

2.2 主要儀器

ZY-75MA 型高壓蒸汽滅菌鍋:浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；JC-100A 型生化培養(yǎng)箱：青島誠瑞信德環(huán)境科技有限公司；JA2003 型分析天平：上海析牛萊伯儀器有限公司；10-100 μL 移液槍:南京烔創(chuàng)科技有限公司；C21-QH2133 型電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；PB-10 型酸度計：金博仕生物技術有限公司；GB/T17623 全自動多功能振蕩儀：得利特科技有限公司。

3 試驗方法

3.1 基礎培養(yǎng)基的制備

3.1.1 操作流程

藥品稱量→溶解→加瓊脂融化→調pH 值→分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板→無菌檢查

3.1.2 操作步驟

①藥品稱量：稱取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂30 g，放到硫酸紙上備用。②溶解：用量簡取1 L 蒸餾水倒入煮鍋中，在電磁爐上小火加熱，添加藥品順序為牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，并用玻璃棒攪拌均勻，以防液體溢出或燒焦，直至藥品完全溶解。③融化瓊脂:瓊脂在95 ℃融化，40 ℃凝固，所以向溶液中加瓊脂要一邊攪拌一邊分多次加入，直至瓊脂完全溶化變粘稠并且無顆粒，停止加熱，補足蒸發(fā)的水分（水需預熱）。④調節(jié)pH:根據培養(yǎng)基對pH 的要求，用1 mo1/L Na0H和1 mo1/L HC1溶液調節(jié)pH至7.2～7.4。用酸度計測定溶液pH 值。⑤分裝：根據需要分裝入試管或三角瓶。分裝量要均勻一致，試管一般為高度的1/5-1/4，三角瓶一般為其體積的1/3-1/2 為宜。⑥包扎、記號:分裝后的試管配好棉塞，7 支試管為一組，包上報紙，用棉繩系好，并標明培養(yǎng)基名稱及日期。⑦滅菌：將所有需要滅菌的物品放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌(121 ℃，20 min)。⑧擺斜面、倒平板：擺斜面時注意斜面的長度不要超過試管總長的1/2-2/3，趁熱倒平板，倒入培養(yǎng)基的量約為15 mL 左右，蓋上上蓋后輕輕晃動，使培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿底部分布均勻，凝固之后成為平板，并貼好標簽，標明培養(yǎng)基名稱。此步需在無菌條件下操作。⑨無菌檢查:將平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設置為37 ℃，培養(yǎng)24 h，檢查滅菌是否徹底，無雜菌生成，冷卻保藏備用。

3.2 菌種活化

3.2.1 操作流程

滅菌操作→分離培養(yǎng)→LB 培養(yǎng)基配制→滅菌→擴大培養(yǎng)→保存

3.2.2 操作步驟

①操作前準備。將接種針、酒精燈、打火機、無菌平板、酒精棉球、鑷子、潔凈燒杯、平板和斜面培養(yǎng)基、菌種等，置于超凈工作臺，打開紫外燈，滅菌20 min。點燃酒精燈,用鑷子取酒精棉球擦拭雙手和臺面。②斜面接種、平板劃線分離。菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，斜持呈45°角，將灼燒滅菌的接種針插入菌種管內，先與無菌落生長培養(yǎng)基接觸，冷卻后，從斜面刮取少量細菌苔，迅速插入接種管。在試管中從下向上做S 形劃線。接種后，立即塞上棉塞，再次灼燒接種環(huán)并將其恢復到原來的位置。按種管貼好標簽后放入試管架，即可進行培養(yǎng)。在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種針，挑取菌苔在平板上Z 字形劃線，其目的是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋分離，獲得足夠的單個菌落。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，封口膜封口。37 ℃倒置培養(yǎng)。③LB培養(yǎng)基的配制。成分：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加蒸餾水至1 000 mL，調pH 至7.2，分裝至50 mL 錐形瓶中，制備150 mL 液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。④擴大培養(yǎng)。用接種針挑平板內單個菌落（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），移至LB 培養(yǎng)液中，在振蕩器內220 rmp/min 振蕩12 h,使細菌分散在培養(yǎng)液中。培養(yǎng)后的菌液放置于4 ℃冰箱保存,不超過一周，為接下來實驗做準備。

3.3 抑菌圈直徑的測定

本試驗供樣菌分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草亞芽孢桿菌，并且通過藥敏紙片法來推斷出鹿血生物活性肽的抗菌效果[7]。用打孔器在定性濾紙上面打出6 mm圓片若干個，用于浸蘸不同濃度的生物活性肽溶液。取鹿血生物活性肽純化溶液33 mL 和五支20 mL 比色管，將33 mL 鹿血生物活性肽純化溶液配成不同濃度梯度（0.0、0.05、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/mL）的六個樣品溶液。方法如下：在第一支比色管中加入鹿血生物活性肽純化溶液1 mL；在第二支比色管中加入活性肽純化液5 mL；在第三支比色管中加入活性肽純化液7 mL；在第四支比色管中加入活性肽純化液9 mL；在第五支比色管中加入活性肽純化液11 mL。再向這五支比色管中分別加入蒸餾水進行稀釋，稀釋至比色管20 mL 刻度線處。第六支比色管中不加樣品，加入無菌水至20 mL 刻度線處即可，作為空白對照組。

用無菌涂布棒輕輕蘸取三種菌液少量多次均勻涂抹在固體培養(yǎng)基表面，再用無菌鑷子輕輕夾取6 mm濾紙片浸入不同濃度稀釋液試管中，使濾紙片完全浸在試管內至少10 s，濾紙片應全部浸有溶液以便保證試驗的準確性。每個菌液培養(yǎng)基中放入不同濃度的三片濾紙片，且均勻分布在培養(yǎng)基內。整個實驗操作均在超凈工作臺中進行，重復試驗3 次后，將平板倒置在生化培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。接著，觀察抑菌結果，并用游標卡尺測量抑菌圈大小。

3.4 最低抑菌濃度的測定

3.4.1 EC 肉湯的制備

成分組成：胰蛋白胨20 g/L、乳糖5 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、磷酸氫二鉀4 g/L、三號膽鹽1.5 g/L。

3.4.2 分光光度法測定菌液OD 值

本試驗選用上述實驗室活化好的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。用接種環(huán)挑取單個菌落于滅菌后的試管內，加入生理鹽水進行稀釋，稀釋至與0.5 麥氏比濁管渾濁程度相同，其作為后面所需的菌懸液。配置好的菌懸液置于振蕩器振蕩內，220 rmp/min 振蕩12 h。然后，將這三種菌懸液分別倒入三支分光光度計比色管內，波長固定在515 nm 處，分別測量出三種菌懸液的OD 值。

3.4.3 最小抑菌濃度測定步驟

方法采用微量肉湯二倍稀釋法[8]，測定鹿血生物活性肽對三種細菌的最小抑菌濃度。在超凈臺內操作，所用儀器均已完全消毒，取96 孔細菌培養(yǎng)板留34 孔作為接下來的試驗，該產品是以伽瑪射線滅菌處理后的，無需再次滅菌。大腸桿菌（A）、金黃色葡萄球菌（B）、枯草芽孢桿菌（C）各11 孔，共A、B、C 三排。在細菌培養(yǎng)板第一排（A）1 到11 孔內用量程最大為100 μL 的移液槍分別加入100 μL EC 肉湯，再向第1 孔中加100 μL 生物活性肽原溶液，濃度為512 μg/mL,用槍頭混勻，然后從1孔內吸取100 μL至第2 孔混勻，混勻后吸取100 μL 至第3 孔，以此連續(xù)倍比稀釋至第11 孔，從第11 孔混勻后吸取100 μL棄去，此時，每孔溶液濃度依次為：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。然后在1 到11 孔依次添加濃度為1×108 CFU/mL 的菌懸液，剩下兩排均重復上述操作。另取一孔只加100 μL EC 肉湯和100 μL濃度為1×108 CFU/mL 菌懸液作為空白對照。以上操作結束后，將96 孔細菌培養(yǎng)板用保鮮膜蓋住防止液體蒸干，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察細菌生長情況。

4 結果與討論

本次實驗測定了不同濃度的鹿血生物活性肽溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌三種細菌的抑菌效果，結果如表1、表2 所示。

表1 生物活性肽純化液對3 種細菌的抑菌效果表

由表1 可知，當鹿血生物活性肽濃度低于0.25 mg/mL 時，對3 種細菌的生長均無抑制效果；當鹿血生物活性肽濃度在0.35～0.55 mg/mL 時，對3 種細菌均有較強的抑制效果。通過觀察發(fā)現，在鹿血生物肽濃度為0.55 mg/mL 時，各菌種的抑菌圈最大。通過游標卡尺測定，實驗中大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為20 mm，金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為18.30 mm，枯草芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為19.50 mm。即實驗所用鹿血活性肽在0.55 mg/mL 濃度下抑菌效果最佳，對大腸桿菌的生長抑制作用最強。

3 種菌懸液的OD 值分別為0.65、0.08、0.11。鹿血生物活性肽對3 種菌的最小濃度測定結果如下：大腸桿菌所測得的最小濃度為0.52 mg/mL，金黃色葡萄球菌的最小濃度為0.97 mg/mL，枯草芽孢桿菌最小濃度為1.36 mg/mL。

5 結語

在一定濃度范圍內，鹿血生物活性肽抑菌效果隨其濃度含量的增大而增強。最小抑菌濃度為0.52 mg/mL，抑菌強度順序依次為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。當鹿血生物活性肽濃度為0.55 mg/mL 時，培養(yǎng)基中大腸桿菌的抑菌圈最大，其直徑為20.00 mm，即本實驗中所用的鹿血生物活性肽溶液在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌3 種細菌中，對大腸桿菌的生長抑制效果最強。