CrCl3預處理和表面活性劑對楊木酶解效率的影響

麥燊怡 ，趙宸彪 ，張紅丹 ，謝 君

（華南農業大學生物質工程研究院，廣州 510642）

0 引 言

長期以來能源生產主要以煤炭、石油、天然氣等化石能源為主，然而，過度消耗化石燃料嚴重破壞了環境，導致全球變暖、環境污染和生態平衡破壞[1]，因此越來越多的人不斷尋求可持續性和環境友好型的可再生能源[2-3]。生物質能源具有可循環利用和環境友好的優勢，其中木質纖維素因其來源廣泛且貯量豐富，被認為是優質的生物質資源[3]。而林木資源作為中國重要可持續發展資源，可以通過生物煉制方法轉化為乙醇等生物燃料，對緩解中國能源供應壓力，維護國家能源戰略安全、減輕污染、實現雙碳戰略等起著重要作用[4-5]。

楊木作為一種速生豐產的樹種，在中國南方和北方均有廣泛種植，由于它們生長迅速、且纖維素含量相對較高，是優良的生產生物質能源的原料。然而楊木原料的纖維素、半纖維素和木素相互交織，形成致密結構，使得木質纖維素很難被直接酶解或微生物降解，因此需要進行預處理以解構生物質原料[6-7]。目前常用的預處理方法有酸堿預處理、高溫液態水預處理、金屬氯化物預處理、蒸汽爆破和有機溶劑預處理、微波預處理等[8-10]。金屬氯化物如CrCl3、AlCl3、FeCl3等絡合金屬鹽具有良好的催化性能，可用于生物質的預處理，這是由于金屬氯化物溶于水后生成的水合氫離子能有效破壞木質纖維素的緊密結構，實現木質纖維素組分的有效分離[11]。相比于AlCl3、FeCl2、ZnCl2，CrCl3作為催化劑進行預處理能很好地去除半纖維素，同時，相比于FeCl3，預處理后產生的糠醛較少[12]。金屬氯化物預處理能夠實現半纖維素的大量去除，但對木素的溶解有限，而殘留的木素會造成對纖維素酶的無效吸附，進一步阻礙了纖維素酶對纖維素的結合。通過在酶解段添加表面活性劑能夠減弱木素存在對酶解的影響，原因是表面活性劑可以通過疏水作用與木質素結合，進而促進酶解效率。此外添加劑的加入可以縮短酶解時間，節省纖維素酶的用量，從而降低酶解成本，提高生產可行性。

本研究以楊木為原料，對不同溫度下CrCl3預處理的效果進行比較，確定最佳預處理溫度以獲得更好的預處理效果及酶解效率。在此基礎上，考察了表面活性劑的種類、用量及酶添加量對酶解效率的促進作用。通過XRD（X-ray Diffraction）、FT-IR（fourier transform infrared）和SEM（scanning electron microscope）分析方法對楊樹和預處理后的固體進行表征，分析了CrCl3預處理后表面形態和內部結構的變化，進一步探索了預處理條件和酶解條件對提高酶解效率的作用機理，為提高楊木的預處理效率和降低酶解成本提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用楊木原料由華南農業大學木工廠所提供，經自然風干至含水率約10%左右，室溫條件下保存。所用纖維素酶購買于丹麥諾維信生物工程技術有限公司，通過DNS法測定出其濾紙酶活力為138 FPU/mL。試驗過程中所用CrCl3、乙酸、乙酸鈉等化學試劑均為分析純。

1.2 CrCl3預處理

稱取15 g絕干楊木原料，以固液比1：10將0.05 mol/L CrCl3均勻倒入150 mL去離子水溶液中，攪拌均勻后倒入反應釜中，密封后進行反應。將攪拌速度設定為300 r/min，分別在150、160、170、180和190 °C下反應20 min。反應結束后，將預處理后樣品采用布氏漏斗進行固液分離，固體部分用去離子水洗滌至pH值為中性，并保存在4 °C冰箱中，用于后續的酶解和分析試驗。

1.3 預處理樣品的酶解試驗

準確稱取2 g絕干底物置于150 mL錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶（20FPU/g預處理后樣品）和100 mL的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L，pH值為4.8）。將酶解樣品置于搖床上進行反應，搖床溫度為50 °C，搖床轉速為150 r/min，定時取1 mL酶解上清液，用于酶解液中糖濃度測定。

1.4 表面活性劑添加試驗

選取5種表面活性劑（乳清蛋白、木質素磺酸鈣、吐溫80、聚乙二醇8 000和曲拉通X-100）為研究對象，按照150 mg/g底物進行添加，探究表面活性劑種類對于酶解效率的影響。

在表面活性劑用量優化試驗中，添加濃度梯度為5、10、25、50、75、100和150 mg/g（絕干底物）的表面活性劑進行酶解試驗，并探究表面活性劑用量對于酶解得率的影響。

在酶用量優化試驗中，按照5、7.5、10、15、20 FPU/g的纖維素酶進行添加，探究表面活性劑用量對于纖維素酶用量的影響。

1.5 分析方法

1.5.1 組分分析

楊木原料中纖維素、半纖維素和木質素的化學組成按照美國可再生能源實驗室（NREL）分析方法進行測定[13]。

1.5.2 葡萄糖濃度的測定

通過高效液相色譜，使用KS-801陽離子交換柱和示差檢測器，以0.4 mL/min的超純水為流動相，在60 °C下對葡萄糖濃度進行分析。葡萄糖得率及添加表面活性劑后葡萄糖增長率分別按下式（1）、式（2）進行計算：

式中m1為酶解液中葡萄糖的質量，g；m2為原料中葡聚糖的質量，g。

式中Y1為添加表面活性劑時葡萄糖得率，%；Y2為未添加表面活性劑時葡萄糖得率，%。

1.5.3 回收率的測定

預處理后固體殘渣中纖維素、半纖維素和木質素含量同樣采用NREL的組分分析方法測定。固體回收率、纖維素回收率、半纖維素和木質素去除率按下式（3）～（6）進行計算：

式中m3為預處理后楊木的質量，g；m4為預處理前楊木的質量，g。

式中m5為固體殘渣中纖維素的質量，g；m6為楊木原料中纖維素的質量，g。

式中m7為固體殘渣中半纖維素的質量，g；m8為楊木原料中半纖維素的質量，g。

式中m9為固體殘渣中木質素的質量，g；m10為楊木原料中木質素的質量，g。

1.5.4 SEM(scanning electron microscope)分析

采用掃描電鏡（EVO18, ZEISS, Germany）分析楊木原料和CrCl3預處理后樣品的表面形貌特征。為增加纖維樣品的導電性，在進行電鏡觀察之前，要對樣品進行噴金處理，并對樣品放大5 000倍后進行觀察和拍照。

1.5.5 X-射線衍射分析

使用X射線衍射儀（Bruker D8-ADVANCE，Karlsruhe, Germany）對楊木原料和CrCl3預處理樣進行結晶度測定。采用Cu Kα (λ=1.54 ?) 輻射源，掃描范圍在2θ=5°～60°。結晶度指數（XCrI）根據Segal 公式(7)進行計算[14]：

式中I002和Iam分別表示002衍射面（2θ=22.5o）和基線的衍射強度（2θ=18.5o）。

1.5.6 紅外分析

采用傅立葉紅外光譜儀（Vertex70，Bruker, Germany）測定了楊木原料和CrCl3預處理后楊木的官能團變化。將樣品與光譜純溴化鉀（KBr）混合，研磨成粉末后用壓片機將混合物壓成薄片，在范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數為32次。

2 結果與討論

2.1 CrCl3預處理溫度的優化

2.1.1 CrCl3預處理溫度對預處理后楊木化學組成的影響

預處理溫度是影響預處理效果的關鍵因素，本研究在固液比為1:10，預處理時間為20 min，攪拌速度為300 r/min條件下，分別考察在預處理溫度為150、160、170、180、190 °C時，CrCl3預處理對楊木化學組成的影響，預處理前后楊木各組分含量的變化如表1所示，試驗結果表明，CrCl3預處理對楊木組分分離有良好的促進效果。預處理前楊木原料纖維素、半纖維素、木質素質量分數分別為45.6%、15.0%、22.9%，當CrCl3預處理溫度從150 °C逐漸升高至170 °C時，半纖維素的去除率由84.7%逐漸增加至95.7%，木質素的去除率在10.4%～14.2%之間，90.4%以上的葡聚糖被保留在預處理后樣品中，此時固體回收率由75.1%逐漸降低至66.1%，這說明預處理后大部分半纖維素、小部分木質素和纖維素發生降解，同時引起了固體回收率的降低。繼續提升預處理溫度至190 °C時，可以基本實現半纖維素的完全去除。木質素的含量雖然呈現逐漸升高的趨勢，但由于溶出的木質素部分重新吸附在纖維表面，阻礙了酸溶木質素的溶出，導致去除率沒有明顯提升[15]。纖維素的降解比較明顯，纖維素含量呈現逐漸降低趨勢，其回收率迅速降低至35.5%，從預處理后樣品顏色形態來看，經190 °C的CrCl3預處理后樣品炭化明顯，導致其回收率和葡聚糖回收率迅速降低，造成原料損失，故認為不適宜選用過高溫度進行反應。

表1 原料和預處理后固體組分分析Table 1 Component analysis of raw and solids after pretreatment%

2.1.2 CrCl3預處理溫度對楊木酶解葡萄糖得率的影響

為進一步評價預處理效果，探討不同預處理溫度（150、160、170、180、190 °C）對CrCl3預處理楊木酶解葡萄糖得率的影響，結果見圖1所示。圖1對比了楊木原料、在不同溫度下經CrCl3預處理楊木及160 °C下不添加CrCl3預處理楊木的酶解葡萄糖得率，楊木原料在酶解24 h后的葡萄糖得率為11.3%，當酶解時間延長到72 h時，原料的葡萄糖得率降至9.9%。經CrCl3預處理后，楊木酶解葡萄糖得率高于原料酶解后的葡萄糖得率，這說明CrCl3預處理能有效提高楊木的酶解效率。隨著CrCl3預處理溫度從150 °C升高到170 °C，葡萄糖得率逐漸升高，從43.3%提升至66.7%，其原因是適當升高溫度有利于半纖維素去除，解構楊木組成，暴露更多的纖維素酶可接觸位點，增加其與纖維素酶的接觸，進而提高葡萄糖得率[16]。當CrCl3預處理溫度逐漸由170 °C增加至190 °C時，酶解葡萄糖得率發生明顯下降，從66.7 %下降到31.1%。從CrCl3預處理后樣品的組分分析可以看出，從170 °C到190 °C，雖然半纖維素得到完全的去除，但纖維素回收率也從90.4%降至35.5%，纖維素的大量損失，導致酶解得率的降低[17]。然而，在170 °C條件下預處理后楊木的葡萄糖得率，較在160 °C條件下僅提高0.8%，因此從能量損耗和成本方面考慮，選擇160 °C作為CrCl3預處理的最佳溫度條件進行后續試驗研究。在固液比為1:10，預處理時間為20 min，反應溫度為160 °C的條件下經CrCl3預處理后，楊木的纖維素回收率、半纖維素和木質素去除率分別為93.6%、90.0%和10.4%，預處理后楊木中纖維素、半纖維素和木質素質量分數分別為61.8%、2.2%、29.7%。相比楊木原料，纖維素質量分數提高35.6%，半纖維素和木質素質量分數分別降低85.5%和29.9%，酶解72 h后葡萄糖的得率比未處理原料提高了568.1%，比不添加CrCl3提高了508.3%。

圖1 預處理溫度對葡萄糖得率的影響Fig.1 Effect of pretreatment temperature on glucose yield

2.2 表面活性劑的添加對酶解的促進作用

2.2.1 表面活性劑類型對CrCl3預處理楊木酶解的影響

研究發現，表面活性劑和部分添加劑可以通過減少酶對木質素的無效吸附，實現纖維素酶解效率的提高[18]。而表面活性劑主要被分為4種類型：非催化蛋白、非離子表面活性劑、離子表面活性劑和生物表面活性劑。本研究主要從3種不同類型的添加劑中選擇了五個具有代表性的表面活性劑（非催化蛋白：乳清蛋白；非離子表面活性劑：聚乙二醇 8 000、吐溫80、曲拉通X-100；離子表面活性劑：木質素磺酸鈣）探究表面活性劑的添加對酶解的影響[19-20]。本研究在pH值為4.8，酶解溫度為50 °C，搖床轉速為150 r/min，酶添加量為20FPU/g底物，表面活性劑用量為150 mg/g底物的條件下，考察了五種不同表面活性劑的添加對CrCl3預處理后楊木酶解效率的影響，結果見圖2所示。

圖2 不同表面添加劑對葡萄糖得率及其增長率的影響Fig.2 Effect on glucose yield and increased yield with different kinds of surfactant

從圖2a可以看出，添加表面活性劑對CrCl3預處理后樣品酶解效率有明顯的提升作用，雖然5種表面活性劑間的提升效果差別不大，但添加木質素磺酸鈣后，酶解過程中的葡萄糖得率均高于添加其他表面活性劑。在樣品中添加木質素磺酸鈣并酶解24 h后，葡萄糖得率達到69.7%，高于未加添加劑的樣品酶解72 h的葡萄糖得率（65.9%），這說明木質素磺酸鈣的加入能顯著縮短酶解時間。繼續延長酶解時間至72 h，葡萄糖得率增加至85.5%。由此可見，木素磺酸鈣對CrCl3預處理楊木的酶解具有良好的促進作用。從圖2b中可以看出,隨著酶解時間的延長，不同表面活性劑對葡萄糖的提升效率不同，但均呈現先增加后降低趨勢，在酶解24 h時提升效率最明顯，增長率處于47.9%～55.0%范圍內。當酶解時間延長至72 h后，其葡萄糖增長率仍然保持在27.6%以上，這是因為表面活性劑可以與木素進行吸附，有效地促進酶解過程中纖維素和酶的結合，提高酶解效率[21]。其中，添加木質素磺酸鈣后，在酶解6、24和72 h的葡萄糖增長率均高于添加其他表面活性劑（乳清蛋白、吐溫80、聚乙二醇8 000和曲拉通X-100）。通過對圖2的綜合分析可知，添加木質素磺酸鈣不僅能縮短酶解時間且能大幅提高酶解效率，是行之有效的促進酶解過程的方法，因此我們將選擇木質素磺酸鈣為表面活性劑進行后續試驗。

2.2.2 表面活性劑用量對CrCl3預處理楊木酶解的影響

以木素磺酸鈣作為表面活性劑，探討不同添加量對CrCl3預處理楊木酶解效率的影響，結果如圖3所示。從圖3a中可以看出，隨著表面活性劑用量從0 增加至75 mg/g底物，葡萄糖得率也逐漸從65.9%增加到85.0%，說明表面活性劑用量對于酶解效率有著顯著影響，足夠的表面活性劑可以與木素充分接觸，為酶提供更多的可接觸纖維素，進而提高酶解效率[22]。繼續提升木素磺酸鈣的用量，當用量達到150 mg/g底物時，酶解72 h后的葡萄糖得率達到85.5%。

圖3 表面活性劑用量對葡萄糖得率和增長率的影響Fig.3 Effect of surfactant dosage on glucose yield and increased yield

通過圖3b中葡萄糖增長率的分析可以看出，隨著酶解時間的延長，其葡萄糖增長率呈現先增加后降低的趨勢，在酶解24 h時達到最大，在14.0%～49.0%范圍內。隨著木素磺酸鈣用量的增加，在酶解前期（<24 h），其葡萄糖增長率逐漸增加，這說明在酶解前期表面活性劑用量對酶解有著顯著影響，表面活性劑用量越多，葡萄糖得率和提升效率增加越明顯[23]。當酶解達到72 h后，其葡萄糖增長率隨著木素磺酸鈣用量的增加呈現先增加后逐漸趨于平緩的趨勢。結合圖3a分析，木素磺酸鈣添加量為75和150 mg/g底物時，葡萄糖得率相近（85.0%和85.5%）且葡萄糖增長率提升較少（從29.0%到29.6%），進一步表明75 mg/g底物是木素磺酸鈣的最優添加量，因此，為節省酶解生產成本，將木質素磺酸鈣的用量減少至75 mg/g底物用于后續研究。

2.2.3 纖維素酶添加量對CrCl3預處理楊木酶解的影響

纖維素酶成本是影響以木質纖維素為原料制備燃料乙醇生產成本的關鍵因素，通過以上的分析可以發現，隨著酶解時間的延長，酶解效率依然不斷提高，故選擇酶解72 h葡萄糖收率進行對比，同時為了節省酶解成本，選擇木素磺酸鈣用量為75 mg/g底物進行酶添加量的優化試驗，結果見圖4所示。由圖4a可以看出，無論是否添加表面活性劑，隨著纖維素酶添加量的增加，葡萄糖得率均呈現逐漸增加的趨勢，說明酶添加量對酶解效率具有決定性的促進作用，當酶添加量較大時，可與纖維素結合的酶越多，酶解效率越好，則葡萄糖得率越高[24]。此外，通過對添加表面活性劑前后酶解效果進行對比，發現在不同酶添加量下，添加木素磺酸鈣對預處理樣品的酶解效率都有明顯的提升作用。在木素磺酸鈣作用下，當纖維素酶添加量為5FPU/g底物時，葡萄糖得率為68.0%，與在酶添加量為20FPU/g底物但不添加表面活性劑時所得葡萄糖得率（65.9%）相當，由此可見，木素磺酸鈣的添加可有效降低酶添加量，并獲得更高葡萄糖得率。在木素磺酸鈣的添加量一定時，當酶添加量從5FPU/g底物逐漸增加到15FPU/g底物，葡萄糖得率也逐漸增加至82.2%，而當酶添加量繼續增加到20FPU/g底物時，葡萄糖得率增加不大，僅增至85.0%，這可能是由于參與反應的纖維素酶已經達到飽和狀態。圖4b展示了酶添加量對葡萄糖增長率的影響，由結果可知，在木素磺酸鈣的添加量一定時，隨著纖維素酶添加量的增加（由5FPU/g增至20FPU/g），其葡萄糖增長率由69.6%逐漸降至28.9%，可見在較低酶添加量下，表面活性劑對酶解的促進作用更為明顯。葡萄糖增長率與酶添加量呈負相關關系可能是因為在酶添加量較多的情況下，可以與纖維素結合的酶越多，表面活性劑發揮作用越有限[25]。綜上所述，加入木質素磺酸鈣可以有效縮減纖維素酶用量，同時提升酶解效率，進而節省酶解成本，因此后續試驗可在較低酶添加量條件下進行。

圖4 纖維素酶添加量對72 h葡萄糖得率和增長率的影響Fig.4 Effect of cellulase loading on glucose yield and increased yield at 72 h

2.3 預處理前后樣品的表征

2.3.1 掃描電鏡（SEM ）分析

對較優條件下楊木CrCl3預處理前后樣品表面形貌變化進行了分析，結果如圖5所示。與預處理后樣品相比，楊木原料的表面結構光滑、完整，呈現致密的結構形態，纖維素、半纖維素和木質素的有序排列使得纖維素酶很難接觸到內部的纖維素束，因此直接進行酶解其葡萄糖得率極低[26]。經過CrCl3預處理后，楊木表面變得粗糙，且出現一些裂痕和孔隙，部分結構松散，大部分纖維素已經暴露出來，預處理過程中的纖維素的溶脹率增大，降低了楊木原料完整結構對酶解的阻礙，提高了纖維素的可接觸面，進而提高了酶解效率[27]。

圖5 原料和CrCl3預處理后楊木的SEM圖Fig.5 SEM scanning electron microscope of raw and chromium (Ⅲ)chloride pretreated poplar

2.3.2 X射線衍射分析

木質纖維素生物質的結晶度是影響酶解效率的重要因素之一，因此，對楊木原料和CrCl3預處理后的樣品進行XRD圖譜和相應的纖維素結晶度指數CrI的分析，結果如圖6所示。從圖6可以看出，原料和預處理后樣品在2θ=15.8°、22.5°和34.5°處都出現了衍射峰，分別對應于結晶纖維素I的101、002和034晶面[28]。木原料CrI值為63.84%，經CrCl3預處理后樣品的結晶度指數CrI升高到71.07%，這是因為預處理過程中無定型態半纖維素的去除，使得預處理后樣品中結晶態纖維素的相對含量增加，從而使得其結晶度CrI值增加[29]。

圖6 原料和預處理后楊木的XRD譜圖Fig.6 XRD (X-ray diffraction) patterns of raw and pretreated poplar

2.3.3 紅外光譜分析分析

楊木原料經CrCl3預處理前后樣品的紅外光譜圖如圖7所示。1 740 cm-1附近存在半纖維素中乙酰基的C=O特征吸收峰，經過CrCl3預處理后此特征吸收峰強度與原料相比明顯減弱，表明CrCl3預處理導致半纖維素的大量降解[30]。而在1 510 cm-1處仍保留了較強的苯環特征吸收峰，說明CrCl3預處理對木素影響較小。在898 cm-1附近出現的β糖苷鍵的特征峰，經CrCl3預處理后該峰強度基本沒有變化，說明CrCl3對楊木的預處理不會導致纖維素的大量降解，保留了大部分纖維素，這也與之前的組分分析結果相一致[31-32]。綜上所述，通過紅外光譜結果進一步證明，CrCl3預處理能夠對半纖維素實現大量去除，但對木質素降解不顯著，并保留大量纖維素，促進后續的酶解過程，這與本研究的結果高度吻合。

圖7 原料和預處理后楊木的紅外光譜圖Fig.7 FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy) spectra of raw and pretreated poplar

3 結 論

CrCl3預處理具有優良的去除半纖維素的能力，能解構木質纖維素原料并有效保留纖維素。本文考察了CrCl3預處理溫度對楊木組分和酶解效果的影響，并對不同表面活性劑的添加、表面活性劑添加量以及纖維素酶添加量對葡萄糖得率和增長率的影響進行了探討，主要結論如下：

1）預處理溫度為160oC時可得較優的酶解效果，在0.05 mol/L CrCl3、固液比1：10、160oC、20 min的預處理條件下，楊木的纖維素回收率、半纖維素和木質素去除率分別為93.6%、90.0%和10.4%，相較于楊木原料，纖維素含量提高35.6%，半纖維素和木質素含量分別降低85.5%和29.9%，72 h后葡萄糖的得率提高了568.1%。

2）在pH值為4.8、酶解溫度為50 °C、搖床轉速為150 r/min的酶解條件下，加入75 mg/g底物用量的木質素磺酸鈣可以有效縮減纖維素酶用量，同時提升酶解效率。

3）通過SEM、XRD、FT-IR分析手段對較優條件下預處理前后樣品進行了表征分析，進一步證明，CrCl3預處理能夠對半纖維素實現大量去除，并保留大量纖維素，但對木質素降解不顯著，為金屬鹽的廣泛應用奠定了基礎。

4）未來在提高預處理效率和降低酶解成本方面，可采用組合預處理以及組合添加劑來開展研究。