一種嵌合式DNA 聚合酶的表達及功能驗證

王 堯，王玉玲，張聞慧，吳銀榮，趙夢然，羅忠宜，林 森

（1.安陽工學院 生物與食品工程學院，河南 安陽 455000；2.澳大利亞外科診斷有限公司，澳大利亞 悉尼 2069；3.安陽康圣環球醫學檢驗所有限公司，河南 安陽 455000）

DNA 的組成成分是脫氧核糖核酸[1]，DNA 聚合酶是DNA 合成的主要功能大分子，通過4 種不同的脫氧核苷酸導入單鏈模板DNA 實現副本DNA 合成。在上述過程中，單個核苷酸與模板DNA 鏈上的堿基通過DNA 聚合酶實現配對。通過該過程高保真聚合酶被廣泛應用到病毒分子研究、分子診斷以及克隆和合成生物學等領域。

目前，常見的聚合酶中，Taq DNA 聚合酶是用于PCR 擴增的最常見的酶[2]。耐熱性極強，在95℃下半衰期為40 min，擴增能力強，但保真性較差。Vent DNA 聚合酶的保真度比觀察到的Taq DNA 聚合酶高5~15 倍。Thermo Scientific Phusion高保真DNA 聚合酶為高性能PCR 設定了黃金標準[3]。Tth DNA 聚合酶是一種具有內在逆轉錄酶活性的熱穩定DNA 聚合酶[4]。Pfu DNA 聚合酶是一種從Pyrococcus furiosus 中分離出來的約90 kDa 的高保真、熱穩定的酶。Phusion 高保真DNA聚合酶的誤差率僅是Taq 的1/50，是Pfu 的1/6。除上述聚合酶外，Q5 高保真DNA 聚合酶為保真度和穩定性設定了新標準，其保真度放大率最高（比Taq 高約280 倍），Q5 具有超低的誤差率。Q5 由一種新型、可熱的DNA 聚合酶組成，該聚合酶融合到增強過程性的Sso7d DNA 結合結構域，提高了性能的速度、保真度和可靠性[5]。Q5 熱啟動DNA 聚合酶利用獨特的aptamer 來增加熱啟動便利性，而無需添加激活步驟。高保真聚合酶精度的提高使它們比標準Taq 聚合酶更適合敏感的下游應用[6]。使用PCR 擴增產生DNA 進行測序時應首選高保真聚合酶，主要因為Taq 聚合酶在PCR 的擴增子中會引起不匹配，影響測序數據的分析。因此，高保真聚合酶比Taq 聚合酶的應用領域更廣[7]。

本研究將通過嘗試不同培養基、純度和濃度等物理條件，快速和經濟地將本實驗室已經建立的嵌合DNA 聚合酶模板進行重組、表達與純化，從而得到一種能比市面上一些低保真度的聚合酶更好、更快地測出所需要數據、有良好保真度和穩健性的高精確度聚合酶，降低實驗過程中聚合酶的出錯率，節約反應時間。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 嵌合DNA 聚合酶的基因合成

目的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，亞克隆至pET11a 載體（NdeI 和EcoRI酶切位點之間），載體攜帶氨芐西林（AMP）抗性，用于陽性菌株的篩選。

1.1.2 儀器設備

全自動臺式快速蒸汽滅菌器、ZEY-2102C 37 度恒溫箱、實用垂直單人凈化工作臺、-80℃超低溫保存箱、4℃冰箱、THZ-82B 氣浴恒溫震蕩器、自動紫外可見分光光度計、INFORS HT恒溫箱、SHAEER 搖床、H4-21KR 落地式高速冷凍離心機、電子天平、ATS 儀器高壓破碎、磁力攪拌器、OHAUS-PH 儀、Nano-300 Microspetrophotometer、SCIOGE 快速離心機、PCR 儀、DYY-12 型電泳儀及其他儀器設備。

1.1.3 主要試劑

50 mol/L Tris-HCl，2 mol/L EDTA，1 mol/L DTT，10 % 甘 油，300 mol/L NaCl，ddH20，Lysis buffer(pH=8)，Elution buffer(pH=8)，Washing buffer 1 (pH=8)，Washing buffer 2 (pH=8)，Binding buffer(pH=8)。

1.1.4 主要培養基配制

1 L 液 體LB 配 方：10 g Tryptone，5 g Yeast Extract， 10 g NaCl， 0.1 g Glucose。

200 mL 固體LB 配方：2 g Tryptone，1 g Yeast Extract，2 g NaCl， 0.02 g Glucose，2.6 g Agar。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白表達

超凈臺內把菌涂在含AMP 的固體LB 培養皿，封口膜封口，放在37℃恒溫箱培養12~16 h。用移液槍槍頭取單菌落放在新的含AMP 固體LB培養皿上，用滅菌后的接種環進行涂開（涂3~4遍）越密越好，封口膜封口，放37℃恒溫箱培養12~16 h。在液體LB中加入AMP抗生素（1∶1000）混合均勻，滅菌接種環接菌在液體LB 中混勻，放在37℃恒溫振蕩器3 h 進行搖菌。取樣到比色皿中，用自動紫外分光光度計測OD 值，約為0.6時加終濃度1 mol/L IPTG 開始誘導。①28℃、120 r/min、37℃搖床6 h ②20℃ 200 r/min 37℃24 h。誘導后的樣品用750 mL 大離心管離心4℃、4 000 r/min、15 min。離心前取200 μL，離心后取5 μL 加20 μL 上樣緩沖液，剩下的分裝到50 mL 的離心管再次離心（4℃、4 000 r/min、 27 min），離心后棄上清，沉淀稱重后存于-80℃冰箱保存。蛋白自誘導表達按照文獻[6]進行。

1.2.2 蛋白破碎

破碎所需的緩沖液與菌體充分混合均勻，放在冰盒上等待破碎。預冷高壓破碎儀，使其達到和樣品相當的溫度，破碎前根據菌液按1 ∶100 加入適量的PMSF。破碎壓力600 左右，破碎2 遍。破碎后取樣30 μL+30 μL 上樣緩沖液用來跑膠，獲取結果。破碎過的菌液用大型落地離心機離心（4℃、16 000 r/min 、20 min），取上清30 μL+30 μL 上樣緩沖液用來跑膠驗證。離心過的上清液轉移至燒杯中，等待硫酸銨沉淀。

1.2.3 硫酸銨沉淀

每毫升分別依次加入0.18 g、0.25 g、0.35 g、0.45 g 硫酸銨，用磁力攪拌器攪拌30 min，4℃離心16 000 r/min30 min，分離上清和沉淀，上清繼續進行硫酸銨沉淀。每次離心后都取上清20 μL加5 μL上樣緩沖液，取1 mg 沉淀加20 μL上樣緩沖液等待跑膠。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

將制膠板進行漏檢、制備8%下層膠（如表1）混勻加至膠板三分之二處、制備5%上層膠（如表1）加滿膠板、插上梳子，等待30~50 min 后即可使用。進行加樣、電泳、染色、脫色和觀測結果。

表1 垂直電泳膠的配制

1.2.5 純化前透析

將樣品放入8-1.4 k 透析袋中，將裝有蛋白的透析袋放入1.2 L 透析液的燒杯中過夜，次日取出樣品到50 mL 離心管中配平離心（30 min、16 000 r/min、4℃）等待純化。

1.2.6 蛋白純化

1 倍柱體積純水過柱清洗20 mL 磷酸纖維素柱料。分別用40 mL Elution buffer 和60 mL Binding buffer 過柱清洗。樣品過柱后收集溜穿液，并標記流穿（FT）。接著依次使用40 mL Binding buffer、40 mL Washing buffer、40 mL Washing buffer、20 mL Elution buffer 和40 mL Elution buffer過柱，分別標記為B、W1、W2、E1 和E2。然后使用60 mL Elution buffer、40 mL Binding buffer 和100 mL 過濾純水過柱清洗，最后用20%無水乙醇保存。將收集起來的所有樣品各取200 μL 做丙酮沉淀待跑膠驗證，將剩余樣品置于冰上，保存于4℃冰箱[9]。

1.2.7 丙酮沉淀

200 μL樣品加入2 mL 離心管中，每管中加丙酮至2 mL 并混勻。將樣品放在-80℃冰箱冷凍10 min。取出樣品解凍，用快速離心機14 000 r/min、4℃離心20 min?；厥丈锨?，把離心管放在干燥箱中60℃干燥10 min，干燥后取出加入20 μL上樣緩沖液。

1.2.8 蛋白測濃度

用移液槍取2 μL樣品蛋白加入Nano-300 微量分光光度計，通過蛋白對280 nm 波長的吸收值獲得蛋白濃度，并記錄。

1.2.9 蛋白濃縮

用濃縮管4 000 r/min、4℃ 濃縮至15 倍。

1.2.10 蛋白酶的活性檢驗

PCR 擴增驗證蛋白酶的活性，5 個50 μL測試體系如表2 所示，95℃持續30 s，56℃持續20 s，72℃持續30 s；循環30，72℃延伸2 min，最終PCR 機器中維持溫度在16℃。

表2 目標DNA 聚合酶PCR 活性測試體系 μL

1.2.11 冷凍保存

每毫升加40%的甘油，混勻，液氮冷凍，-80℃冰箱保存得到的聚合酶。

2 實驗結果

2.1 自動誘導和IPTG 誘導重組表達的比較分析

用不同的溫度、時間和體積（5 mL 和10 mL）對目標蛋白進行誘導表達。結果如圖1 所示，經SDS-PAGE檢測可知，自動誘導28℃ 表達效果最好。

圖1 誘導表達的SDS-PAGE 分析

M-7 分別是蛋白質Marker，1 和2 是誘導前樣品，3 和4 是IPTG 28℃ 誘導后細胞樣品，5 是IPTG 20℃ 誘導后細胞樣品，6 是自動誘導25℃誘導后細胞樣品，7 是自動誘導28℃ 誘導后細胞樣品。星號標記處為目標蛋白條帶。

2.2 硫酸銨分級沉淀蛋白

對表達的樣品進行破碎后硫酸銨沉淀，硫酸銨沉淀的目的是為了達到初步純化。結果如圖2所示，經SDS-PAGE 分析可知，蛋白在0.25 g/mL和0.35 g/mL 硫酸銨沉淀時表達效果最好，因此將采用0.25 g/mL 和0.35 g/mL 沉淀進行純化。

圖2 破碎和硫酸銨分級沉淀SDS-PAGE 膠結果

圖2 從左到右依次：M 是蛋白Marker，1 是對照，2 是破碎后蛋白，3 是破碎后蛋白上清，4是上樣緩沖液，5 和6 分別是0.18 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，7 和8 分別是0.25 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，9 是上樣緩沖液，10 和11 分別是0.35 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，12 是上樣緩沖液，13 和14 分別是0.45 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，星號標記處為目標蛋白條帶。

2.3 離子交換層析柱純化

對硫酸銨沉淀的樣品用DEAE 柱進行第一步純化（圖3a），用磷酸纖維素柱進行再次純化（圖3b）。根據純化后丙酮沉淀SDS-PAGE 分析結果可知，W2、E1 和E2 樣品含有目標蛋白，且雜蛋白含量較少。下一步將有目標蛋白的樣品透析，并測蛋白活性和濃度。

圖3 離子交換層析柱純化聚合酶SDS-PAGE 膠結果

圖3 （a）中M 為蛋白質Marker，1-7 分別為離心后上清、離心后沉淀、FT 樣品1、FT 樣品2、E1 樣品、L1 樣品和E2 樣品；圖3（b）中M 為蛋白Marker，1-6 分別為FT 樣品、B1 樣品、W1樣品、W2 樣品、E 1 樣品和E2 樣品。

2.4 PCR 鑒定聚合酶活性

對小規模PCR 擴增的樣品跑瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察結果。如圖4 所示，本試驗表達及純化的DNA 聚合酶比商用聚合酶的活性好，PCR 產物更多，表達更明顯。

圖4 PCR 測定酶的活性

M 為DNA Marker；1-4 為本試驗所表達的聚合酶；5 為商用聚合酶。

3 討論

保真度在DNA 復制中非常重要的[10]。DNA堿基配對中的錯配會產生不同類型的突變，有可能導致蛋白質功能失調，并且有致癌的可能。許多DNA 聚合酶都包含1 個核酸外切酶結構域，其作用是檢測堿基對是否錯配，并進一步執行移除不正確的核苷酸，然后由正確的核苷酸取代。盡管不同的錯配導致不同的結構特性，但DNA 聚合酶仍然能夠均勻地檢測和區分它們，并保持DNA復制的保真度。DNA 聚合酶還是許多誘變過程的關鍵，并被廣泛用于生物技術中。利用大腸桿菌表達系統對目的DNA 聚合酶進行表達，有培養周期短、表達水平高、成本低等優點[11]。有關DNA 聚合酶的制備技術一直在不斷的優化，主要是提高酶的表達量、特異性、酶活力等[12-13]。將DNA 聚合酶從重組大腸桿菌中提取以及純化的方法主要有凍溶法和柱層析等方法。此外，有研究用Bio-rex70 離子交換法和聚乙二胺(PEI)沉淀對DNA 聚合酶進行純化[14]。還有研究使用乳糖對重組大腸桿菌進行誘導，經過破胞和粗提取后，再依次過JK110 離子交換柱和SephadexG-75 凝膠柱獲得純化的聚合酶[15]。

本研究分別從菌體濃度、誘導劑濃度和誘導表達時間3 個方面進行優化得出最佳誘導條件，即 菌 液 的OD600為0.841 時 加 入1.5 mmol/L 的IPTG 進行誘導，培養時間為12 h。優化條件可使該聚合酶的大量提取生產成本降低，為大批量生產嵌合DNA 聚合酶奠定了基礎。同時，通過SDS-PAGE 檢驗可得在此誘導條件下獲取的酶純度較高，由此可知經過本試驗的純化步驟可除去大部分雜蛋白。最后，通過PCR 擴增以及瓊脂糖凝膠電泳比較商品聚合酶和本試驗提取純化的酶液的活性，結果顯示兩者活性相當，實驗室提取純化的嵌合式DNA 聚合酶的作用效果優于市售商品酶。

4 結論

（1）本研究測試了嵌合高保真DNA 聚合酶在不同溫度和時間下的表達情況，在28℃自動誘導中蛋白表達量較高。用硫酸銨沉淀進行提純，獲得初步純化的嵌合高保真DNA 聚合酶。

（2）采用陰離子和陽離子交換層析柱純化后，獲得較純的嵌合高保真DNA 聚合酶。通過PCR 反應對獲得高保真聚合酶進行活性分析，確認了上述工藝獲得的高保真聚合酶具有聚合酶活性。