SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化在消化道腫瘤診斷和預后預測中價值的研究進展

單陽陽 張健鋒 毛振彪

盡管在消化道腫瘤治療方面的研究已取得了較大進展，但在全球范圍內消化道腫瘤的病死率仍較高，結直腸癌（CRC）、胃癌、原發性肝癌的病死率分別為9.2%、8.2%、8.2%[1]。因此，應用非侵入性方法檢測早期腫瘤標志物十分重要，而DNA 甲基化是被研究得較多的表觀遺傳修飾，DNA 甲基化水平和模式的改變，可以導致抑癌基因沉默，或原癌基因激活，進而增高腫瘤的發生風險。矮小同源盒基因2（SHOX2）和Ras相關結構域家族1A（RASSF1A）基因是多種腫瘤信號通路的調節劑，已被證明可以促進腫瘤的發生和進展；SHOX2 和RASSF1A基因甲基化檢測的敏感度較高，尤其在疾病早期階段[2]。本文就SHOX2 和RASSF1A基因功能及其作用機制，以及DNA 甲基化修飾在消化道腫瘤診斷和預后預測中價值的研究進展作一綜述。

1 SHOX2 和RASSF1A 基因功能及其作用機制

1.1 SHOX2 基因

SHOX2 是一種促癌基因，其是細胞增殖、凋亡的調節劑及上皮-間質轉化（EMT）的誘導劑，除了促進腫瘤進展的作用外，SHOX2 在骨骼發育、胚胎發育和心血管系統分化中也起著重要的促進作用[3]。SHOX2 同源基因位于3 號染色體上，其CpG 島高甲基化頻發，并在肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細胞癌（ESCC）和肝細胞癌（HCC）等腫瘤組織和細胞中表達升高[4]。研究發現，在早期非小細胞肺癌患者中，SHOX2 基因啟動子甲基化與不良預后相關，其通過下游靶基因促進腫瘤的發生、EMT 和骨轉移，并與耐藥有關[5]。在乳腺癌細胞中，SHOX2 是EMT 的新型誘導因子，其表達水平與乳腺癌患者的生存率密切相關；SHOX2 可在轉錄水平直接激活促轉移基因WASF3 的表達，導致腫瘤轉移潛能顯著增強，并將信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）招募至WASF3 基因啟動子，STAT3與SHOX2 形成功能性免疫復合物，增強了乳腺癌細胞中WASF3 的轉錄活性，這提示SHOX2/STAT3/WASF3 信號通路可能可以促進腫瘤轉移[6]。此外，SHOX2 還能通過上調Runt 相關轉錄因子2（RUNX2）的表達以抑制抑癌基因p53 的活性，導致腫瘤發生[7]。

1.2 RASSF1A 基因

RASSF1A是被研究得較為深入的抑癌基因，在機體正常組織中廣泛表達，能調節細胞周期、參與細胞凋亡和穩定微管，并參與生長調節；此外，RASSF1A還參與腫瘤的發生和轉移，其編碼的支架蛋白能通過正反饋或負反饋機制調節復雜信號網絡中的信號轉導[8]。RASSF1A位于3p21.3 染色體區域，對多種腫瘤的遺傳和表觀遺傳變化敏感，可調節多條腫瘤相關信號通路并干擾多種細胞過程。在多種腫瘤（如乳腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、前列腺癌等）中均能檢測到異常的RASSF1A基因甲基化[9]。RASSF1A還與腫瘤的淋巴結轉移、血管侵犯及化學治療藥物耐藥有關。腫瘤組織中RASSF1A 缺乏的主要原因是RASSF1A等位基因雜合缺失和啟動子中CpG 島超甲基化而失活，DNA甲基轉移酶（DNMT）能介導該類CpG 島甲基化，因此腫瘤細胞中DNMT 活性增強可導致RASSF1A基因高甲基化，進而使蛋白質表達降低。研究表明，RASSF1A 的Sarah 結構域可使RASSF1A 與RASSF異構體結合以形成同源二聚體或異源二聚體，并與巰基丙酮酸硫轉移酶（MST）蛋白的Sarah 結構域相互作用，以激活Hippo 信號通路，該通路是重要的促凋亡信號通路[10]。Schmidt 等[11]的研究發現，RASSF1A 敲除細胞中IL-6 表達升高且炎性反應增強，IL-6 可通過上調腫瘤細胞中的DNMT1 表達以促進RASSF1A基因高甲基化并抑制RASSF1A轉錄?？梢姡琑ASSF1A甲基化和促炎性細胞因子表達升高在腫瘤發生和轉移中有協同作用。

2 SHOX2 基因甲基化在消化道腫瘤中的作用

2.1 SHOX2 基因與食管癌

ESCC 是中國較常見的食管癌病理分型，由于該腫瘤的早期侵襲性、易發生淋巴結和器官轉移導致治療效果不佳，患者的預后較差。實時熒光定量PCR 結果顯示，SHOX2 在ESCC 組織和細胞中表達上調，是EMT 的調節因子，在體內外均能誘導ESCC 細胞增殖、侵襲和轉移；當miR-375 過表達時，SHOX2 表達降低，ESCC 細胞的增殖、侵襲和轉移能力減弱，這提示SHOX2 是ESCC 的促癌基因，miR-375 可通過抑制SHOX2 的表達以抑制EMT[12]。因此，miR-375/SHOX2 信號通路可能是治療ESCC 的新靶點。

2.2 SHOX2 基因與胃癌

臨床研究表明，SHOX2 表達升高與胃癌患者總生存率較低顯著相關，是影響胃癌患者預后的因素；該研究還發現，長鏈非編碼RNA（lncRNA）IGF2-AS 在胃腺癌（GAC）中起著重要的調控作用，作為miR-503 的競爭性內源RNA，其可上調SHOX2的表達，與GAC 患者預后不良有關[13]。研究顯示，與正常組織相比，GAC 組織中SHOX2 表達升高，尤其在小鼠感染幽門螺桿菌（Hp）后，SHOX2轉錄水平顯著升高，這提示SHOX2 基因甲基化與GAC 的發生、發展有關[14]。SHOX2 基因是否可作為GAC 患者的預后預測標志物，尚待進一步研究。

2.3 SHOX2 基因與CRC

循環游離DNA（cfDNA）中的SHOX2 和胞裂蛋白9（SEPT9）基因甲基化是CRC 篩查、診斷和分期的生物標志物。結腸腺瘤和CRC 組織中SHOX2 基因甲基化水平顯著高于正常組織；SEPT9或SHOX2 基因甲基化檢測可能有助于區分CRC 或結腸腺瘤與正?；蜓仔越Y腸組織，并可區分晚期腺瘤與非晚期腺瘤，該結論還需進一步的研究驗證[15]。Bergheim 等[16]的研究檢測了184 例CRC 患者術前和術后3～10 d 的ccfDNA 甲基化水平，結果 顯 示 治 療 前ccfDNA 中SHOX2 和SEPT9 基 因甲基化水平與國際癌癥控制聯盟（UICC）分期、TNM 分期、組織學分級，以及淋巴浸潤和囊外淋巴結擴散密切相關，治療后SHOX2 和SEPT9 基因甲基化水平與UICC 分期相關；ccfDNA 中SHOX2基因甲基化水平與UICC 分期（Ⅰ～Ⅳ）、淋巴結分期（N0～N2）、組織學分級（G1～G3）和淋巴浸潤（L0～L1）程度均呈正相關，這有助于TNM 分期的診斷及個體化治療方案的制定。此外，SHOX2與CRC 的發生、發展有關。Yang 等[17]的研究發現，SHOX2 能 通 過 調 節lncRNA SNHG11/miR-339-3p 信號通路促使CRC 進展；敲低SHOX2 可抑制CRC 細胞的增殖、遷移和侵襲；這提示SNHG11/miR-339-3p/SHOX2 信號通路是CRC 發生、發展的重要調控機制。

3 RASSF1A 基因甲基化在消化道腫瘤中的作用

3.1 RASSF1A 基因與胃癌

多數胃癌患者確診時已為晚期，可選擇的治療方案有限。胃癌的發病機制涉及多種遺傳和表觀遺傳改變，胃癌組織中RASSF1A基因甲基化水平較正常胃組織顯著升高[18]。Karamitrousis 等[19]研究了105 例出現轉移的胃癌患者和20 名健康對照者的血液樣本，結果發現其中68 例患者存在RASSF1A基因啟動子甲基化，而健康對照者無RASSF1A基因啟動子甲基化；此外，在46例疾病進展患者中，有35 例存在RASSF1A基因啟動子甲基化，提示RASSF1A基因啟動子甲基化與治療效果相關。多種基因的表觀遺傳修飾是胃癌進展的關鍵因素。Karamitrousis 等[20]的研究評估了70例 晚 期 胃 癌 患 者ccfDNA 中RASSF1A、SOX17 和WIF-1 的甲基化狀態，發現在出現轉移的胃癌患者中，抑癌基因RASSF1A甲基化最為常見，其余依次為SOX17 和WIF-1；與無甲基化的患者相比，RASSF1A基因啟動子甲基化的患者的無進展生存期和總生存期均較短。由于該研究的樣本量較小，未來需進一步研究以揭示RASSF1A等基因甲基化是否可作為預測胃癌患者預后的生物標志物。

3.2 RASSF1A 基因與CRC

RASSF1A基因高甲基化與CRC 患者的總生存期較短和預后不良有關[21]。80%～90%的CRC 是由腺瘤性息肉和結直腸側向發育型腫瘤（LST）發展而來，有研究發現，LST 患者的RASSF1A基因甲基化水平介于腺瘤性息肉與CRC 之間，提示其可能可以早期診斷CRC[22]。此外，CRC 患者的生存率、腫瘤轉移和腫瘤分化均與RASSF1A基因啟動子甲基化水平有關[23]。Hu 等[21]的薈萃分析結果顯示，RASSF1A基因甲基化與較高的CRC 發病風險和較短的總生存期有關，這提示RASSF1A是預測CRC 發病風險和預后的生物標志物。Blanchard等[24]的研究發現，在包括結腸癌在內的多種腫瘤中，抑癌基因叉頭框轉錄因子M1（FOXM1）會導致抑癌基因RASSF1A表達升高，這有助于開發晚期CRC 的藥物聯合治療方案。研究發現，MGMT、RASSF1A與SEPT9 基因啟動子甲基化聯合檢測診斷CRC 的敏感度、特異度、陽性預測值和ROC 曲線下面積（AUC）分別為96.6%、74.0%、91.5%和0.97，其診斷效能優于表觀遺傳學生物標志物（NGFR/SEPT9/TMEFF2，SFRP2/RASSF）[25]。今 后尚需評估體液（尤其是血液）中MGMT、RASSF1A和SEPT9 基因啟動子甲基化聯合檢測的診斷效能，以開發可應用于臨床的檢測方法。

3.3 RASSF1A 基因與HCC

RASSF1A基因異常甲基化是診斷HCC 的潛在生物標志物，甲胎蛋白（AFP）診斷HCC 的特異度較高，但敏感度僅為47%[26]。一項薈萃分析結果顯示，RASSF1A基因甲基化與AFP 聯合檢測可提高HCC 的診斷率。研究發現，HBV 介導HCC 發生的表觀遺傳基礎是HBV 編碼的X 蛋白通過上調DNMT1 誘導RASSF1A基因啟動子甲基化，抑制RASSF1A表 達[27]。在 診 斷HBV 相 關HCC 時，相較于AFP 檢測，血清RASSF1A基因甲基化檢測的敏感度和特異度較高[28]。因此，AFP 與RASSF1A基因甲基化聯合檢測可有效鑒別HCC 與慢性乙型肝炎（CHB），也可預測HCC 的進展和預后[23]。Kim 等[29]應用AFP 與尿ccfDNA（TP5 基因突變、RASSF1A基因甲基化和GSTP1 基因甲基化）聯合檢測方法，在186例HCC 患者中檢出148 例，診斷的敏感度和特異度分別為79.6%和90%；與AFP單獨檢測相比，聯合檢測檢出的病例數增加了30%，并且提高了早期HCC 的檢出率。因此，AFP與尿ccfDNA 聯合檢測對HCC 的診斷效能較好，尤其是對AFP 未顯著升高的HCC 患者，該檢測有潛力作為非侵入性HCC 篩查方法。

3.4 RASSF1A 基因與胰腺癌

胰腺癌的病死率較高，美國胰腺癌患者的5年生存率約為10%[30]。盡管在胰腺癌的診斷和治療方面已取得重大進展，但早期診斷仍較為困難，多數患者確診時已處于晚期，預后較差。胰腺癌的易感性與基因突變和表觀遺傳修飾相關[31]。Asano等[32]對33 例胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤（IPMN）患者的手術切除標本的46 個解剖區域進行了分析，發現RASSF1A基因甲基化在潛在惡性區域較良性區域多見，這提示RASSF1A基因高甲基化與IPMN進展、惡變及較差的預后有關。此外，Henriksen 等[33]的研究納入了346例胰腺導管腺癌（PDAC）Ⅰ～Ⅳ期患者和25 例慢性胰腺炎患者，該研究對血清cfDNA 樣本進行了包含RASSF1A在內的多種基因甲基化的特異性PCR 檢測，并與血清CA19-9 聯合檢測，結果顯示PDAC 患者血清cfDNA 的高甲基化基因數量多于慢性胰腺炎患者；此外，該研究中基因甲基化與血清CA19-9 聯合檢測診斷PDAC的AUC 為0.93，大于血清CA19-9 單獨檢測，提示其有潛力作為診斷PDAC 的生物標志物，并有助于鑒別PDAC 和慢性胰腺炎。

4 總結

SHOX2 和RASSF1A基因在消化道腫瘤的發生、發展、轉移及耐藥中均起著重要作用，這2 種基因甲基化檢測分別與其他指標聯合檢測被認為是較好的消化道腫瘤篩查和監測方法，具有較高的敏感度和特異度。在消化道腫瘤患者體內，SHOX2表達升高，而RASSF1A表達則降低，兩者的甲基化水平均明顯升高[34]。研究表明，當SHOX2 和RASSF1A與其他異常甲基化基因聯合檢測時，其特異度和敏感度顯著升高。需要注意的是，僅應用基因甲基化檢測結果指導臨床實踐的可靠性不高，需與常規檢測方法聯合應用。綜上所述，SHOX2和RASSF1A基因有潛力作為早期消化道腫瘤診斷和預后預測的生物標志物，也可作為腫瘤治療中表觀遺傳調控的靶標。DNA 甲基化檢測的敏感度較高且較為客觀，其與液基脫落細胞學檢查聯合應用可以彌補細胞學檢查敏感度較低的缺點。DNA 甲基化檢測也可以作為組織細胞形態學檢查的輔助診斷工具。