生物酶預處理對桐木脫色的影響*

李書磊 張 紅 李一博 袁潔瑩 謝非凡 王寒星 楚 杰 余瑞金

（1. 西北農林科技大學化學與藥學院 楊凌 712100；2. 臨沂市檢驗檢測中心 臨沂 276699；3. 西北農林科技大學林學院 楊凌 712100）

我國是世界上唯一擁有最完整的泡桐屬（Paulownia）植物種群的國家，每年泡桐木材產量超過1 000 萬m3；桐木作為重要的工業用材，廣泛用于室內建筑裝修及家具和工業建筑等行業，每年約有200 萬m3桐木制品出口日本、韓國等國家，桐木的生產利用已得到越來越多國家的青睞（常德龍等，2018）。然而在實際生產中，泡桐易變色的問題會使材色品質降低，開展桐木漂白研究對提升桐木附加值及提高桐木品質具有重要意義。

漂白預處理是木材材色改良的有效途徑之一，當前木質材料漂白主要采用化學試劑法和物理蒸煮法（曹惠敏等，2020；陸弘毅等，2021）。Shi 等（2018）利用酸和堿水溶液對木材進行熱處理，結果表明，隨著溫度升高，樣品亮度值降低，化學結構發生變化，半纖維素和木質素有所降解；Wu 等（2019）研究發現，過氧化氫漂白可以保持木質細胞的微觀結構；也有學者應用不同條件水熱處理進行木材漂白（劉志佳等，2009）。這些傳統漂白預處理方法為提高木材漂白效果及優化木材漂白工藝提供了一定基礎，但目前采用的漂白預處理試劑多為含氯漂白劑，其使用中會產生二噁英化合物，從而造成環境毒性污染（許開紹等，2002）。張潤青等（2020）采用臭氧對非木質纖維進行漂白和改性，該方法雖污染小但存在漂白成本高且工藝復雜等問題。為了進一步獲得綠色高效的木質原料漂白效果，國內外學者在原料脫色機理方面也相繼開展研究。有學者認為，泡桐木材變色是多因素共同作用的結果，pH 是影響梓醇變色的主要因素，光照和氧氣同時作用可導致泡桐素和芝麻素變色（常德龍等，2018）；木質素內的羰基結構有助于增加熱處理過程中的木材色度值，色度值受C—O 基團影響（曹惠敏等，2020）；且顯示與木質素的O/C 比相反的趨勢（Zhanget al.，2018）。這些研究為桐木變色機理分析奠定了一定基礎，但對試劑脫色處理相關機理探索還有待進一步深入，尤其對綠色低碳預處理條件下不同脫色方法的研究還較為罕見。

生物酶因綠色、溫和、高效的特點，被認為是一種具有較大發展前景的漂白方法。生物酶漂白主要通過降解材料中殘留的木質素或增強紙漿的可漂性，減少紙漿漂白過程中的氯用量，從而減少漂白對環境的污染（盧慶華等，2013；馮嚴嚴，2014；潘夢麗等，2015；李峰等，2018）。當前，采用生物酶預處理體系對桐木材料進行漂白還鮮見報道。鑒于此，本研究以蘭考泡桐（Paulownia elongata）為研究對象，探討二代生物復合酶對桐木的漂白效果和影響規律，獲得生物復合酶漂白桐木的最佳工藝參數，初步探明生物復合酶漂白桐木的機理，以期為桐木脫色和生物學改良及桐木制漿的發展提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

蘭考泡桐樣品由國家林業和草原局泡桐研究中心提供。樣品洗凈、干燥，切成5.0 cm×5.0 cm×0.5 cm小塊，烘干，裝入密封袋并標記名稱、日期等置于陰涼干燥處。

所用生物復合酶酶種為CTEC2，來源Novozymes，酶活147 FPU·mL-1；檸檬酸、碳酸鈣、溴化鉀、氫氧化鈉等，均為分析純。

所用儀器包括水浴鍋、電子天平、真空泵、干燥箱、離心機、紫外可見分光光度計、振蕩器、粉碎機、高壓滅菌鍋等；葡萄糖、木糖含量使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測。

1.2 預處理樣品制備

配制5 FPU·mL-1酶溶液，用檸檬酸和氫氧化鈉調節pH。每塊樣品質量約15 g，料液比1∶10。木塊經絕干處理后置于試管中，加入已配制好的酶溶液搖勻，抽真空。水浴鍋溫度分別設30、50 和70 ℃。試管放入水浴鍋加熱，每15 min 搖勻1 次，直至分別反應60、75、90 和105 min 后取出試管，抽濾。抽濾后用蒸餾水沖洗，置于玻璃培養皿內，烘至絕干后裝入密封袋中。同時，設置1 組未經預處理的平行試驗。

1.3 顏色測定

采用杭州彩譜科技有限公司生產的CS-820 可見光分光測色儀，照明光源為脈沖氙燈，測量波長范圍400～700 nm，波長間隔10 nm，反射測量D/8 結構，操作溫度15～32 ℃，相對濕度不超過80%，反射測量孔徑為1.5 cm 的中孔徑。每塊樣品由邊緣向中心測量3個點，結果取平均值。

采用CIELab 表色系統，使用分光測色儀測量泡桐木材樣品表面預處理前后的明度L*、紅綠軸色品指數a*和黃藍軸色品指數b*。用脫色處理前后參數差值表示各參數變化，即ΔL*、Δa*、Δb*和色差ΔE*，計算公式如下：

式中：下標t 表示脫色處理后；下標u 表示脫色處理前。

1.4 主要化學組成測定

1.4.1 抽提物含量 濾紙折疊包好裝入的原料，置于索氏抽提器內，量取200 mL 乙醇倒入索氏抽提器。水浴鍋95 ℃抽提16 h，直至抽提管中液體完全無色、透明。取出濾紙包置于通風櫥中至乙醇揮發完全，再將其放入烘箱內60 ℃烘至絕干后稱重，計算抽提物含量。

1.4.2 纖維素、半纖維素含量 參照美國國家可再生能源實驗室（national renewable energy laboratory，NREL）方法測定樣品三大素含量。首先稱取0.3 g 預處理樣品（未處理原料用苯醇進行索式抽提，以除去樹脂、色素等）于100 mL 旋蓋燒口瓶中，加入 3 mL 72% H2SO4，混合均勻后置于30±3 ℃水浴中保溫1 h，每隔10 min 攪拌搖勻1 次；然后向瓶中加入84 mL 蒸餾水（稀釋H2SO4溶液質量分數至4%），擰緊瓶蓋置于高壓滅菌鍋內，121 ℃下水解1 h。水解完成后，利用已稱重的G3 砂芯漏斗進行真空抽濾，分離殘渣和水解液，一部分水解液用于測定酸溶木質素含量；另一部分水解液用碳酸鈣中和至中性，采用高效液相色譜（HPLC）HITACHI L-2000 分析其葡萄糖和木糖含量。分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87P，長×直徑為300 mm×7.8 mm，保護柱為Cation-H Refill Cartridges，長×直徑為30 mm×4.6 mm，檢測器為RID 示差折光檢測器。進樣量20 μL，流動相0.005 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫45 ℃。檢測結果為水解液單糖含量，六碳糖乘以0.9、五碳糖乘以0.88 即可換算出樣品纖維素和半纖維素含量。

1.4.3 木質素含量 預熱紫外可見分光光度計20 min 后，開始稀釋濾液（稀釋后總體積1 mL 左右），搖勻，倒入溶液中，測定吸光度，顯示吸光度0.7～1.0范圍內即為可行。采用該方法測定并記錄所有收集的濾液，按下式計算酸溶木質素（acid-soluble lignin，ASL）含量：

式中：N為稀釋倍數；A為紫外吸收值；V為濾液吸收總體積（0.087 L）；15 為吸收系數（L·g-1cm-1）；W為酸解前樣品絕干質量。

水解后殘渣用熱蒸餾水多次洗滌抽濾，直至10%BaCl2檢測濾液無白色沉淀生成后，置于事先用3%H2SO4浸泡潤洗、干燥并稱重的定量濾紙上。恒溫干燥箱內105 ℃烘至恒重，稱重，總質重扣除定量濾紙的質量即為酸不溶木質素質量。

1.4.4 脫色率 采用分光光度法測定吸附前后溶液的吸光度。根據標準曲線方程計算染料質量分數，按下式計算脫色率：

式中：c0為處理前桐木溶液吸光度測定值；c為處理后桐木溶液吸光度測定值。

1.5 樣品熱重分析

熱重分析（thermo gravimetric analysis，TGA）/微分熱重（derivative thermo gravimetry，DTG）采用TGA/DSC3型熱重同步分析儀進行。樣品粉碎，過80 目篩，隨機稱取2 mg 進行分析。熱解溫度800 ℃，升溫速率20 ℃·min-1，同時加入20 mL·min-1流量氮氣。

1.6 電鏡掃描

采用TM4000 Plus 臺式掃描電鏡，電子束能量為15 kV。樣品粉碎，過80 目篩，使用導電膠粘取少量粉末固定在觀察臺上進行掃描，觀察預處理后樣品纖維微觀形態變化。

1.7 X 射線衍射

采用X 射線衍射（D8 ADVANCE A25）測定樣品纖維素結晶度，探究不同預處理條件對樣品結晶的影響。樣品粉碎，過200 目篩，稱取10 mg 進行測量。操作電壓40 kV，電流40 mA，掃描角度2θ 范圍5°～50°，銅靶。

2 結果與分析

2.1 預處理前后桐木顏色變化分析

未處理泡桐木材顏色參數為L*=60.70、a*=3.73、b*=16.60，預處理后顏色參數變化如表1 所示。可以看出，與未處理相比，生物酶預處理后的泡桐木材明度L*、紅綠軸色品指數a*、黃藍軸色品指數b*均有所提高，表明生物酶預處理可有效提高白度。由溫度分析可知，50 ℃預處理條件下樣品明度L*最大，紅綠軸色品指數a*和黃藍軸色品指數b*隨溫度升高而降低。在pH 變化條件下，紅綠軸色品指數a*和黃藍軸色品指數b*隨pH 升高而降低，當pH 為7 時，樣品明度L*最大。隨著預處理時間延長，樣品明度L*越來越高，紅綠軸色品指數a*和黃藍軸色品指數b*越來越低。考慮到明度L*是色差的主要影響因素，故在溫度50 ℃、pH 7、預處理時間105 min 條件下泡桐木材脫色效果最佳。

表1 預處理后脫色桐木的顏色參數Tab. 1 Color parameters of decolorization of paulownia after pretreatment

2.2 預處理前后桐木主要化學組分變化分析

由圖1 可知，經生物復合酶預處理，泡桐木材主要化學組分均發生較明顯變化，纖維素相對含量有所增加，半纖維素、木質素和抽提物含量有所降低。在溫度50 ℃、pH 為7 的條件下，主要化學組分相對含量變化最大，其中纖維素含量由49.11%增至59.87%，半纖維素含量由18.58%降至7.45%，酸溶木質素含量由7.12%降至4.07%，酸不溶木質素含量由24.64%降至20.42%，抽提物含量由3.24%降至2.09%。從pH分析可知，pH 為7 時泡桐木材主要化學組分相對含量變化最大，其次是pH 為5，pH 為3 時泡桐木材主要化學組分相對含量變化最小，原因在于pH 降低導致CTEC2 生物酶活性降低，從而引起其作用效果下降（Patelet al.，2019）；半纖維素、木質素等結構復雜，比纖維素更易發生酸性水解（Pathaniaet al.，2016）。從溫度條件可知， 50 ℃預處理條件下泡桐木材主要化學組分相對含量變化最大，其次是30 ℃，70 ℃時泡桐木材主要化學組分相對含量變化最小，這可能是因為預處理溫度50 ℃時CTEC2 生物酶活性最好，作用效率最高（Patelet al.，2019）；而與30 ℃相比，70 ℃對酶活性影響更大，導致酶活性更低，進而降低酶對組分的作用效果。

圖1 生物復合酶預處理桐木主要化學組分變化情況Fig. 1 Main chemical components of paulownia under the condition of biological complex enzyme pretreatment

2.3 預處理前后桐木脫色率變化分析

由圖2 可知，在溫度50 ℃、pH 為3 的條件下，桐木脫色率最低，僅21.8%；在溫度30 ℃、pH 為7 的條件下，桐木脫色率達68.8%。50 ℃預處理條件下，pH由3 到7，桐木脫色率由21.8%升至49.9%；70 ℃預處理條件下，桐木脫色率變化幅度很小，基本保持不變。針對以上結果，有學者認為桐木變色與抽提物有關，抽提物中酚類物質是引起變色的重要原因（常德龍等，2018）；也有學者認為主要是糖或有機酸在變色中起作用（祖勃蓀等，1998），此外還有花苷類（邱乾棟等，2013）；常德龍等（2006）指出，在真菌引起變色的泡桐木材中，半纖維素發生明顯降解，半纖維素含量發生變化導致桐木脫色。本研究提出的預處理前后桐木脫色率變化與前人觀點基本一致。

圖2 溫度和pH 對桐木脫色率的交互作用Fig. 2 Interaction of temperature and pH value on decolorization rate for paulownia of enzyme pretreatment

2.4 預處理前后桐木熱重變化分析

不同溫度和pH 預處理桐木的TGA 和DTG 曲線如圖3、4 所示，所有樣品的TGA 曲線變化趨勢基本一致，除溫度70 ℃和pH 為7 條件下樣品的熱穩定性變化不明顯外，其他樣品熱穩定性均有所提升。樣品質量損失主要包括50～300 ℃的平穩熱解階段、300～400 ℃的主要熱解階段和400～600 ℃的炭化階段。

圖3 不同溫度預處理桐木的TGA 和DTG 曲線Fig. 3 TGA and DTG curves at different temperatures

由圖3 可知，預處理后主要熱解階段樣品最大質量損失速率均有所降低，最大質量損失速率對應的溫度有所增加，說明預處理可延長達到最大質量損失速率的時間。在主要熱解階段，30 ℃和50 ℃條件下預處理樣品熱解失重峰溫度升高，熱穩定性有所上升；70 ℃條件下預處理樣品與未處理樣品熱解溫度差別不大；不同溫度預處理樣品的熱解溫度由大到小依次為30 ℃、50 ℃和70 ℃。這與CTEC2 酶最適溫度有關，高溫時酶活性降低，導致其對木質纖維的破壞程度降低（Patelet al.，2019）。綜上所述，桐木熱穩定性變化預處理溫度依次為30 ℃＞50 ℃＞70 ℃。

由圖4 可知，在主要熱解階段，pH 變化導致桐木熱解溫度和速率發生變化，最大質量損失速率有所降低。預處理樣品最大質量損失速率對應的溫度有所增加，說明pH 不同會導致桐木主要化學組分在熱解和成分轉化過程中產生差異（楚杰等 ，2017）。pH 為3 和5 時，預處理桐木的熱解溫度有所升高，熱穩定性有所提高；pH 為7 時，預處理桐木的熱解溫度變化不大。綜上所述，桐木熱穩定性變化的預處理pH 依次為 3＞5＞7。

圖4 不同pH 預處理桐木的TGA 和DTG 曲線Fig. 4 TGA and DTG curves at different pH values

2.5 預處理前后桐木電鏡掃描圖像分析

預處理前后泡桐木質纖維素組分變化示意如圖5所示。未經預處理的木質纖維素組分中層狀木質素與半纖維素呈半包裹狀態，木質素密實細胞覆蓋纖維素結構細胞；經生物酶預處理后， 木質素細胞脫除，暴露出更多規則成束的纖維素細胞。

圖5 預處理前后泡桐木質纖維素組分變化示意Fig. 5 Schematic diagram of changes in lignocellulose components before and after pretreatment

未處理樣品表面無明顯結構破壞，木質纖維較完整（圖6A）；溫度30 ℃時，不同pH 預處理樣品（圖6B、C 和D）木質纖維表層結構遭到破壞，木質纖維素開始解體，纖維素互相分離，且隨著pH 升高，結構變化明顯；溫度50 ℃時，不同pH 預處理樣品（圖6E、F 和G）木質纖維素解體更加嚴重，纖維素分離更加顯著，且隨著pH 升高，結構變化更加明顯；溫度70 ℃時，不同pH 預處理樣品圖6H、I、J）木質纖維的變化趨勢與30 ℃和50 ℃預處理樣品一致，且隨著pH 升高，結構變化更加顯著，但70 ℃預處理樣品的結構變化不如50 ℃明顯。可見，復合生物酶能有效降解桐木的木質纖維組分，破壞其木質纖維結構。

圖6 不同預處理桐木的SEMFig. 6 SEM images of enzyme pretreatment paulownia

2.6 預處理前后桐木X 射線衍射分析

預處理前后桐木X 射線衍射圖譜如圖7 所示，101、002 和040 峰是典型的纖維素Ⅰ的特征，其衍射角分別為16.02°、22°和34.76°。經生物酶預處理后，101 峰衍射強度無明顯變化；但經50 ℃預處理后，002 峰衍射強度明顯增強，說明此時半纖維素、木質素等無定形區降解效率最高；040 峰尖銳程度明顯增大，且位置有所向右偏移，說明經50 ℃預處理后，衍射強度明顯增強，纖維素結晶度增大，結晶區晶胞參數變小、晶面間距變小。

圖7 預處理前后桐木X 射線衍射圖譜Fig. 7 The X-ray diffraction spectrogram of paulownia sample before and after pretreatment

纖維素結晶度是由X 射線衍射測得的光譜峰高，計算公式如下：

式中：CI 為纖維素結晶度；I002為002 晶面的極大衍射強度，2θ 約22°；Iam為非結晶背景的衍射強度，2θ 約18°。

由表2 可知，未處理桐木樣品纖維素結晶度為16.91%，這主要是因為木質素和半纖維素等部分無定形物質的存在使得結晶度較低。經生物酶預處理后，桐木樣品結晶區表面纖維素分子鏈中的低聚糖被溶出，無定形區活性基團裸露，半纖維素與生物酶發生反應，部分木聚糖被降解，導致纖維素結晶度提高（楚杰等，2017）。生物酶降解，結晶度增加較為明顯的預處理條件為溫度50 ℃、pH 7，但由于酶的作用使纖維素結晶區發生部分水解，因此結晶度提升程度不大。

表2 不同預處理泡桐的纖維素結晶度①Tab. 2 Crystallinity calculation parameters

利用Scherer 公式（Segalet al.，1959）計算桐木結晶區尺寸，公式如下：

式中：D為結晶區長度或寬度；d為晶面層間距（nm）；B為衍射峰半寬，計算中需將其轉換為弧度；λ 為入射波波長（0.154 nm）；θ 為衍射角；K為衍射常數。

由表3 可知，預處理后樣品結晶區長度D增大，表明酶預處理能夠提高桐木結晶區尺寸，且在一定范圍內隨溫度和pH 上升提高更加明顯，溫度70 ℃、pH為7 時D達最大。此外，預處理后樣品晶面層間距變小，但變化幅度較小，主要是因為桐木結晶區表面纖維素分子鏈中擁有的部分低聚糖溶解，導致細胞壁吸附能力變強，加速半纖維素與生物復合酶的反應，從而使d減小（楚杰等， 2017）。

表3 不同預處理桐木結晶區大小①Tab. 3 Calculation parameters of crystallization zone

3 結論

1） CTEC2 生物酶可使泡桐木材主要化學組分發生變化，最佳預處理條件為溫度50 ℃、pH 7，木材纖維素含量由49.11%增至59.87%，半纖維素含量由18.58%減至7.45%，酸溶木質素含量由7.12%減至4.07%，酸不溶木質素含量由24.64%減至20.42%，抽提物含量由3.24%減至2.09%。

2） CTEC2 生物酶預處理泡桐木材時，溫度50 ℃、pH 7、預處理時間105 min 的漂白效果最好，木材明度最大。

3） CTEC2 生物酶預處理泡桐木材可以提高其熱穩定性（處理條件溫度70 ℃、pH 為7 時變化不明顯）。依據熱穩定性高低排序的預處理溫度為30 ℃＞50 ℃＞70 ℃、pH 為3＞5＞7。CTEC2 生物酶預處理泡桐木材最大質量損失速率對應的溫度在不同溫度和pH 條件下均有所增加，預處理可延長達到最大質量損失速率的時間。

4） CTEC2 生物酶預處理泡桐木材不僅能夠提高纖維素結晶度，使其結晶區尺寸增大，晶面層間距變小，而且能夠有效破壞木質纖維素的致密結構，在相同溫度下，其作用隨預處理pH 提高而更加明顯。