芳樟醇、桉葉油素取食脅迫下香樟齒喙象（鞘翅目：象甲科）幼蟲的生長發育及抗性基因的轉錄表達*

王璟廷 李壽銀 左 壯 徐文軒 郝德君

（南京林業大學南方現代林業協同創新中心 南京林業大學林學院 南京 210037）

植物與昆蟲協同進化過程中，植物通過合成復雜多樣的次級代謝產物以抵御植食性昆蟲的取食（陳澄宇等, 2015; Yactayo-Changet al., 2020）。萜類化合物是一種揮發性次生物質，廣泛存在于各種植物體內（Mithoferet al., 2012）。作為一種碳基化合物，該類化合物的結構組成以5 個碳的異戊二烯為基本單元，分為半萜、單萜、倍半萜、多萜以及系列萜類衍生物（Mithoferet al., 2012）。已有研究表明，萜類化合物對植食性昆蟲具有拒食、產卵趨避、抑制生長發育、毒殺以及引誘天敵等直接或間接防御作用（Seyboldet al., 2006; Loivamakiet al., 2008）。香樟是我國南方重要的常綠樹種，廣泛用于園林綠化和涵養水源，樹體富含大量芳樟醇、桉葉油素等單萜類含氧衍生物（張峰等, 2017；Liet al., 2022），基于這些萜類化合物形成一套特異性的化學防御系統，抑制昆蟲的存活、生長發育以及繁殖。例如，芳樟醇和桉葉油素對長紅錐蝽（Rhodnius prolixus）具有較強的熏蒸毒性和趨避作用（Sfaraet al., 2009）；桉葉油素對蘋果黃蚜（Aphis pomi）具有毒殺作用（Wei et al., 2019）；合成芳樟醇的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）可以抑制棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的產卵（Mccallumet al., 2011）。香樟形成了基于萜類化合物的化學防御系統，但是某些昆蟲已經進化出對香樟萜類防御物質的適應機制，實現以香樟作為寄主植物。然而，目前并未建立起某種專性為害香樟的昆蟲與其寄主香樟間互作關系的深入研究。

昆蟲為克服寄主植物次生物質的防御，也進化出相應的適應機制。其中，昆蟲的解毒代謝機制已經開展廣泛研究（陳澄宇等, 2015; Heidel-Fischeret al.,2015; Despréset al.,2007）。植物次生化學物質在昆蟲體內的代謝可以分為3 個階段（Sabinaet al., 2015）：第1 階段，在細胞色素P450 酶系（cytochrome P450，CYP450）和羧酸酯酶（carboxylesterases，COE）等解毒酶作用下，催化羥基、羧基等親核官能團加入到外源化合物中，使其極性增加，易溶于水；第2 階段，在UDP-葡萄糖醛酸轉移酶（UDP- glycosyltransferases，UGTs）和谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）等轉移酶作用下，將第1 階段的產物與糖分子和谷胱甘肽等內源性分子軛合，使之易溶于水；第3 階段，在ATP 轉運蛋白（ATP binding cassette transporter，ABC）作用下，將軛合物運出細胞膜，最終排出體外。通常，參與外源物質代謝的解毒酶具有可誘導性。大量研究顯示，不同外源物質脅迫能夠誘導昆蟲相關解毒酶基因的上調表達。例如，蘋果蠹蛾（Cydia pomonella）幼蟲取食含有香豆素和槲皮素的人工飼料后，中腸內CYP332A19和CYP337B19顯著上調表達（陳高滿等, 2020）；COE2、CYP6-like 5和BtGST2的上調表達參與煙粉虱（Bemisia tabaci）對咖啡因、尼古丁、槲皮素等次生物質的代謝適應（Halonet al., 2015）；華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）在華山松（Pinus armandii）萜類熏蒸脅迫下CYP6基因家族表現出明顯的誘導響應模式（Daiet al., 2015）。

表皮蛋白（cuticular protein, CP）是昆蟲體壁的主要成分，在昆蟲表皮形成和發育中具有重要作用。昆蟲通過大量合成表皮蛋白，與幾丁質形成復合體，沉積于原表皮層，使得表皮厚度增加，減少外源化合物的滲透，緩解了昆蟲體內解毒代謝壓力，降低了外源化學物質進入靶標位點的概率，形成表皮抗性（cuticular resistance）（梁欣等, 2014; 孫雅雯等, 2015;Balabanidouet al., 2018）。昆蟲表皮抗性作為殺蟲劑抗藥性機制之一，已在衛生害蟲研究中被證實。例如，溴氰菊酯抗性品系的淡色庫蚊（Culex pipiens）共有14個表皮蛋白基因上調（Fanget al., 2015; Panet al.,2009），類似的結果在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）中也有報道。除蟲菊酯和DDT 抗性品系按蚊的CPLCG3、CPR124、CPR127、CPR129基因表達量遠高于敏感品系（Awololaet al., 2009）。然而，有關昆蟲表皮蛋白在抵御植物次生物質的功能研究尚未見報道。但有研究表明，昆蟲在寄主轉換過程中大量表皮蛋白基因出現差異表達，推測表皮蛋白參與昆蟲對不同寄主植物化學物質的適應（Birnbaumet al., 2020）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 香樟的1～3 年生新鮮枝條采自南京林業大學校園，帶回實驗室后去除葉片，保留枝干部分，清洗干凈后晾干。利用高速萬能粉碎機FW100（天津市泰斯特儀器有限公司）粉碎后過80 目篩，將粉末置于4 ℃下儲存，備用。

1.1.2 供試昆蟲 香樟齒喙象幼蟲采自上海市松江區泖港鎮香樟人工純林（30°56′6.15″ N ，121°12′32.76″E），帶回實驗室后參照Li 等（2021）的方法進行人工飼養，飼養條件：溫度28 ℃±1 ℃，相對濕度70%±5%，光周期為16∶8（L∶D）。選擇健康的羽化成蟲置于養蟲盒內配對，收集卵粒，待卵孵化后，選擇生理狀態一致的初孵幼蟲用于后續試驗。

1.1.3 試劑和試劑盒 芳樟醇（CAS: 78-70-6，純度95%）和桉葉油素（CAS: 470-82-6，純度99%），購自南京斑馬實驗器材有限公司。HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 毒力測定

采用人工飼料混藥法（Pintoet al., 2003）進行毒力測定。分別配制不同質量分數的芳樟醇（0、2、4、6、10、12、30、50、70、100、150 以及200 mg·g-1）和桉葉油素（0、1、2、3、5、7、20、40、50、70、90 以及100 mg·g-1）的人工飼料。利用不同質量分數處理的飼料喂食香樟齒喙象初孵幼蟲72 h，記錄死亡個數（用毛刷撥動蟲體，無明顯生命跡象的幼蟲視為死亡個體）。每個質量分數處理組設置不少于60 頭幼蟲。

1.3 芳樟醇和桉葉油素長期脅迫下香樟齒喙象幼蟲生長發育指標測定

根據預試驗結果，設定2 種質量分數處理（芳樟醇：10.0 mg·g-1和19.7 mg·g-1；桉葉油素：5.0 mg·g-1和15.2 mg·g-1），隨機選擇200 頭初孵幼蟲進行取食脅迫飼養，直至化蛹。以未添加2 種萜類的飼料喂養的幼蟲作為對照。定期記錄不同處理幼蟲的蛻皮次數、體重以及死亡情況。根據幼蟲各齡期的存活率（LV）、發育歷期（DT）和體重（BW）指標，計算相對表現指數（relative performance index, RPI）（Sotoet al., 2014）。公式如下：

在偵查決策中，決策方案隨著案件條件不同而各異。在某一起案件偵查中發揮重要作用的決策方案不一定能夠應用于其他同類案件。針對未發案件所作的應急決策方案雖然可以參考、借鑒以往偵破的成功方案，但是針對已發案件的決策方案則不能簡單的照搬、刻板的模仿，偵查決策方案的風險因素更加復雜。因而如何評價偵查決策方案，盡可能地將偵查決策中的風險因素降低，以更好地實現偵查目的就成為需要研究的內容。筆者認為在評價偵查決策時，應主要衡量偵查成本、偵查效益兩個因素。

1.4 基于qRT-PCR 的基因表達量測定

1.4.1 RNA 提取和第一鏈cDNA 合成 參照1.3 中處理方法，分別選取LC15濃度下芳樟醇和桉葉油素飼養至4 齡的香樟齒喙象幼蟲，以及對照組幼蟲各15 頭。每個處理組設置3 個生物學重復，每個重復5 頭幼蟲。液氮速凍后用于總RNA 提取。利用TRIzol 提取法，提取各個樣品總RNA，并檢測RNA 質量和濃度。RNA 完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.4.2 實時熒光定量PCR 根據前期香樟齒喙象轉錄組測序數據（Chenet al., 2020），參照黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、 赤擬谷盜（Tribolium castaneum）解毒酶基因（Matthewset al.,2015; Richardset al., 2008）進行本地blast 比對， 分別挑選5 條CYP450、COE、UGT、GST、ABC 以及表皮蛋白基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0 設計實時熒光定量PCR 特異性引物（附表1）并通過blastx 比對到NCBI nr 庫分析基因同源性（附表2）。使用SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒在Applied Biosystem 7500 實時熒光定量PCR 系統進行PCR 反應。反應體系：5 μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix （2×），上下游引物（10μmol·L-1）各0.4 μL，2 μL cDNA 模板，7.2 μL ddH2O。每個反應體系設置3 個技術重復。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，循環數為40。

附表1 所選香樟齒喙象有關解毒酶基因和表皮蛋白基因轉錄組基因序列引物Appendix 1 The selected primers for detoxification gene and cuticle protein gene in Pagiophloeus tsushimanus

附表2 香樟齒喙象有關解毒酶基因和表皮蛋白基因轉錄組基因序列同源性分析Appendix 2 Homology analysis of gene sequence related to detoxification enzyme gene and epidermal protein gene transcriptome of Pagiophloeus tsushimanus

1.5 數據處理與分析

利用二次邏輯回歸函數對毒力測定結果進行擬合，計算半數致死濃度（LC50）和亞致死濃度（LC15），回歸函數表達式如下：

式中，y為香樟齒喙象幼蟲死亡率（%），x為藥劑質量分數（mg·g-1），a1、a2、p、x0為參數。通過卡方列檢驗（P＜0.05）確定最大非致死濃度（LC00）。使用Kruskal-Wallis ANOVA 檢驗分析不同階段的發育歷期、幼蟲和蛹的重量（P＜0.05），進行成對檢驗以評估處理之間的差異顯著性。使用Kaplan- Meier 生存分析法繪制不同次生物質、不同質量分數處理下香樟齒喙象幼蟲的存活曲線，通過對數秩檢驗確定各個處理間是否存在顯著差異性。以RPS3 和18sRNA 作為雙內參基因（Chenet al., 2020），采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。利用單因素方差分析（ANOVA）以及t檢驗，分析處理組與對照組之間基因表達量的差異顯著性。所有數據處理及繪圖工作均在軟件Origin 2021b 中完成。

2 結果與分析

2.1 芳樟醇和桉葉油素的毒力分析

采用人工飼料混藥法對香樟齒喙象初孵幼蟲的毒力結果見圖1。可知，香樟齒喙象幼蟲在取食添加芳樟醇和桉葉油素的人工飼料3 天后，2 種萜類的致死中濃度LC50分別為47.2 、41.7 mg·g-1，說明香樟齒喙象對于芳樟醇比桉葉油素顯現出更高的耐受性。通過卡方列檢驗，芳樟醇和桉葉油素的最大非致死濃度分別為10.0 、5.0 mg·g-1，亞致死濃度LC15濃度分別為19.7、15.2 mg·g-1。

圖1 芳樟醇和桉葉油素對香樟齒喙象初孵幼蟲的室內毒力測定結果Fig. 1 Toxicity of linalool and eucalyptol to newly hatched larvae of P. tsushimanus

2.2 2 種質量分數芳樟醇和桉葉油素對香樟齒喙象幼蟲存活率和發育歷期影響

由圖2 可以看出，取食含有不同質量分數的芳樟醇和桉葉油素人工飼料的香樟齒喙象幼蟲生長齡期存在差異。結果表明，2 種萜類的脅迫均引起香樟齒喙象幼蟲的發育歷期延長。在芳樟醇和桉葉油素LC00劑量下，香樟齒喙象一齡幼蟲齡期無顯著影響，從2 齡開始直至化蛹，發育歷期延長。在芳樟醇和桉葉油素LC15劑量下，香樟齒喙象各齡齡期均有所延長。在5 齡和預蛹期，2 種萜類物質對香樟齒喙象幼蟲影響最大，齡期增加10～20 天。在桉葉油素和芳樟醇脅迫下，香樟齒喙象幼蟲的發育歷期從長到短的依次為芳樟醇19.7 mg·g-1（120.41 天）＞桉葉油素15.2 mg·g-1（114.79 天）＞芳樟醇10.0 mg·g-1（109.78 天）＞桉葉油素5.0 mg·g-1（99.24 天）＞對照組CK（88.66 天）。

圖2 2 種質量分數芳樟醇和桉葉油素對香樟齒喙象幼蟲發育歷期的影響Fig. 2 The effects of two mass fraction of linalool and eucalyptol on the development duration of P. tsushimanus larvae

取食含有不同質量分數芳樟醇和桉葉油素的人工飼料對香樟齒喙象不同齡期幼蟲體重的影響結果見表1。可以看出，在芳樟醇和桉葉油素脅迫下，香樟齒喙象幼蟲各個發育階段的取食和消化能力均受到影響，處理組幼蟲的體重顯著低于對照組（P＜0.05）。取食19.7、10.0 mg·g-1處理的芳樟醇和15.2 mg·g-1處理的桉葉油素飼料的蛹重明顯小于對照組（P＜0.05），而桉葉油素5.0 mg·g-1脅迫下，處理組和對照組的蛹重無明顯差異（P＞0.05）。

表1 2 種質量分數芳樟醇和桉葉油素脅迫下對香樟齒喙象幼蟲體重和蛹重的影響①Tab. 1 The effects of two mass fraction of linalool and eucalyptol on the larval and pupa weight of P. tsushimanus

利用Kaplan-Meier 生存分析法繪制香樟齒喙象幼蟲在不同質量分數的芳樟醇和桉葉油素的存活曲線，并進行卡方檢驗。結果如圖3 所示，可知含有不同質量分數的芳樟醇和桉葉油素的半人工飼料飼喂幼蟲的存活曲線存在明顯差異（χ2=300.679，P＜0.001）。通過比較死亡時間，發現香樟齒喙象幼蟲死亡集中于初孵和蛻皮時，即0～3、6～12、18～21、30～33 天幾個時間節點，由于試蟲在這些節點剛完成蛻皮進入下一齡期，相對較脆弱，故死亡率較高。觀察發現，幼蟲表現為頭殼發白，體壁僵硬，喪失進食能力。

圖3 2 種質量分數芳樟醇和桉葉油素脅迫下對香樟齒喙象存活率的影響Fig. 3 The effects of two mass fraction of linalool and eucalyptol on the survival rate of P. tsushimanus

結合體重、齡期、存活率等指標，將其組合成相關表現指數（RPI），作為評價香樟齒喙象對2 種次生化學物質的活性指標。由表2 可知，取食不同質量分數芳樟醇和桉葉油素飼料的香樟齒喙象幼蟲的相關表現指數均小于對照組，當質量分數提高，差距則增大。以上結果表明，不同質量分數芳樟醇和桉葉油素均可抑制香樟齒喙象幼蟲的生長，且抑制作用隨著質量分數的增加而增強。

表2 2 種質量分數芳樟醇和桉葉油素引起的香樟齒喙象幼蟲相關表現指數Tab. 2 The relative performance index of linalool and eucalyptol under the stress of two mass fraction in P. tsushimanus

2.3 芳樟醇和桉葉油素對香樟齒喙象幼蟲解毒酶基因和表皮蛋白酶基因表達的影響

在芳樟醇和桉葉油素兩種萜類的脅迫下，香樟齒喙象4 齡幼蟲解毒酶基因和表皮蛋白基因表達特性見圖4。在2 種質量分數芳樟醇的脅迫下，細胞色素P450 基因家族中CYP1、CYP3、CYP4 基因表達和表皮蛋白基因家族中CP1、CP3、CP4、CP5 均顯著上調（P＜0.05），GST1、GST2、GST5 的基因則明顯下調表達（P＜0.05），其他解毒酶基因表達和對照組無明顯差別（P＞0.05）。在2 種質量分數桉葉油素脅迫下，UGT1基因顯著上調表達（P＜0.05），COE1 基因則明顯下調表達（P＜0.05），其他解毒酶基因和表皮蛋白基因與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 芳樟醇、桉葉油素脅迫下香樟齒喙象4 齡幼蟲解毒酶和表皮蛋白基因表達情況Fig. 4 Relative expression levels of detoxification genes and cuticule proteins in P. tsushimanus fourth larvae with linalool and eucalyptol

3 討論

植物為應對植食性昆蟲侵害進化出多重的防御機制（謝輝等, 2012）。其中，復雜多樣的次生代謝物質構成了植物的化學防御系統（Nishida, 2014; 劉興平等, 2003）。已有研究表明，萜類次生物質廣泛存在于植物體內，對昆蟲具有毒殺、趨避等生物活性（Huanget al., 2017）。本研究選取芳樟醇和桉葉油素2 種香樟樹體內主要萜類，測定其對專性為害香樟的香樟齒喙象的生物活性。結果表明，在芳樟醇和桉葉油素短時脅迫下，初孵幼蟲表現出不同程度上的耐受性，即半致死濃度（LC50）分別為19.7 和15.2 mg·g-1。然而，長期取食含有芳樟醇和桉葉油素的人工飼料，香樟齒喙象幼蟲的生長發育受到不同程度的抑制作用，并且這種抑制作用隨2 種萜類濃度增加而增強，可能是由于植物次生物質對昆蟲的影響僅在一定濃度下起作用（陳澄宇等. 2015; Mauryaet al., 2020）。

盡管萜類化合物一定程度上為香樟提供了防御作用，但仍有超過20%的香樟齒喙象通過延長發育歷期，降低蛹重等方式在低劑量脅迫下完成了其幼蟲階段的生長發育，進入蛹期。值得注意的是，萜類脅迫下香樟齒喙象幼蟲集中死亡發生于蛻皮期前后，表現為無法完成蛻皮過程或鞣化不完全，可能是由于舊表皮褪去，而新表皮剛剛形成，該階段的下表皮對外源萜類化合物的阻隔能力較弱，導致短時間內大量萜類進入蟲體而引起死亡。這一現象在類似研究中也被報道，如甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）在有機磷殺蟲劑處理后，蛻皮后氣管邊出現裂縫、角質層畸形等現象，導致其在蛻皮期大量死亡（Adamskiet al., 2009）。淡色庫蚊幼蟲在新煙堿類殺蟲劑處理后，蛻皮過程中其頭殼無法完全脫去，引起死亡（Songet al., 2016）。基于這一現象，未來可以香樟齒喙象表皮合成相關基因作為潛在的分子靶標，為開發新型防治技術提供理論依據。

為進一步明確香樟齒喙象幼蟲體內可能參與響應芳樟醇和桉葉油素脅迫的關鍵功能基因，分別測定了幾種解毒酶基因和表皮蛋白基因的轉錄表達水平。結果發現，芳樟醇脅迫能夠同時誘導香樟齒喙象幼蟲體內細胞色素P450 酶和表皮蛋白的上調表達。昆蟲細胞色素P450 酶可通過羥基化、環氧化等方式代謝萜類物質，例如，中歐山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）進化出完善的細胞色素P450 酶解毒代謝體系以代謝寄主植物的次生代謝物質，其中CYP6DJ1基因將松油烯和檸檬烯氧化為乙醇和環氧化物，CYP6DE1 基因將α-派烯、β-派烯氧化為醇類物質（Blomquistet al., 2021; Chiuet al., 2019a; Chiuet al.,2019b）。本研究中，芳樟醇誘導香樟齒喙象幼蟲的CYP1、CYP3、CYP4 3 條基因上調表達，暗示CYP450參與芳樟醇的代謝分解，后續將深入研究芳樟醇在香樟齒喙象體內的代謝途徑，以驗證CYP450 酶的代謝功能。表皮蛋白作為昆蟲體內重要的結構蛋白，大量富集于上表皮和外表皮，構成昆蟲抵御外源化學物質的物理屏障（Balabanidouet al., 2018; Moussian, 2010）。研究發現，昆蟲表皮蛋白基因數量超過該昆蟲基因組中蛋白質編碼基因總數的1%，在昆蟲生長發育、繁殖、環境適應中發揮重要作用（梁欣等, 2014; Charles,2010）。在岡比亞按蚊、淡色庫蚊等昆蟲中發現，化學農藥脅迫下會誘導表皮蛋白基因的表達，導致表皮層增厚，增強對化學農藥的阻隔，提高自身抗藥性（Yahouedoet al., 2017; Fanget al., 2015; Lillyet al.,2016）。但是，表皮蛋白基因介導昆蟲抵御植物次生物質的作用報道較少。已有研究發現，植食性昆蟲在轉主脅迫后由表皮蛋白基因構成的表皮結構成分具有顯著差異（Birnbaumet al., 2020），表明植食性昆蟲在轉移到新寄主后可能利用表皮蛋白應對其中的植物次生物質。本研究發現，芳樟醇誘導香樟齒喙象幼蟲CP1、CP3、CP4、CP5 4 條CP 基因上調表達，表明香樟齒喙象幼蟲可能通過合成大量表皮蛋白，引起表皮增厚，進而減緩芳樟醇的滲透作用。因此，尚需探究芳樟醇脅迫后幼蟲表皮厚度的變化以及表皮蛋白的富集定位，明確香樟齒喙象對芳樟醇的解毒代謝機制。

此外，本研究發現桉葉油素取食脅迫并未誘導解毒酶基因和表皮蛋白基因的明顯表達，僅有1 條UDP-葡萄糖醛酸轉移酶基因的表達量顯著上調。可能是由于不同外源化合物種類、處理質量分數均會對相關基因的表達響應產生不同影響。例如，咖啡因和苯巴比妥能夠誘導黑腹果蠅細胞色素P450 酶和谷胱甘肽-S-轉移酶基因的上調表達，但二嗪農、氯吡脲等殺蟲劑則無誘導作用（Willoughbyet al., 2006）。類似的結果在甜菜夜蛾中也有報道，高效氯氟氯氰菊酯、氯蟲腈、甲氟腙和茚蟲威可以誘導甜菜夜蛾體內細胞色素P450 酶和UDP-葡萄糖醛酸轉移酶基因的上調表達，但阿維菌素則表現出明顯的抑制作用（Huet al.,2019）。毒力測定結果表明香樟齒喙象幼蟲對桉葉油素更敏感，說明桉葉油素抑制了香樟齒喙象體內相關解毒酶系的活性，有助于提高寄主植物對香樟齒喙象的防御能力。

4 結論

香樟齒喙象幼蟲對芳樟醇和桉葉油素具有一定的耐受能力，但是在長期脅迫下其生長發育則受到不利影響。其中，芳樟醇脅迫同時誘導幼蟲體內細胞色素P450 酶和表皮蛋白基因的上調表達，而桉葉油素脅迫僅誘導幼蟲體內一條UGT 解毒酶基因的上調表達。香樟齒喙象幼蟲能夠調控自身解毒代謝機制和表皮阻隔作用，以適應香樟的化學防御。