高血壓腎病患者血清PEPT1和PEPT2表達與腎功能減退及預后的相關性分析*

雷 琳,董有睿,王曉平

貴州航天醫院/遵義醫科大學附屬航天醫院健康管理科,貴州遵義 563000

高血壓腎病是高血壓最常見的并發癥,基本病理特征為腎小動脈硬化繼發的腎實質損害,發病機制主要為腎臟血流動力學改變和血管重構導致[1]。高血壓可誘發腎纖維化或腎小管間質纖維化,纖維化組織逐漸取代正常腎組織,導致腎功能衰竭,20%～40%腎病患者在腎活檢確診后20年內最終進展為終末期腎病(ESRD)[2]。研究顯示不受控制的血壓增高是ESRD的主要危險因素,高血壓患者較健康人群增加2倍的ESRD風險,加強血壓控制可能會減緩慢性腎病的進展,降低ESRD的風險[3-4]。腸肽轉運蛋白(PEPT)1、PEPT2在肽類物質和藥物吸收發揮著關鍵的作用,腸黏膜和腎臟組織中PEPT表達異常可影響降壓藥物的吸收,降低其生物利用度[5],不利于血壓控制。因此推測PEPT1、PEPT2可能與高血壓腎病存在一定關聯,本研究通過檢測血清PEPT1、PEPT2水平,分析其與高血壓腎病預后的關系,以期為臨床診治提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2020年1月本院腎內科收治的192例高血壓腎病患者作為高血壓腎病組。男121例,女71例,年齡52～75歲,平均(62.35±5.49)歲,高血壓病程8～16年,平均(12.65±2.85)年,高血壓腎病病程5～14年,平均(9.15±2.65)年,合并疾病:冠心病38例,腦梗死29例,慢性阻塞性肺疾病19例。納入標準:(1)符合《中國高血壓防治指南2010》中診斷標準[6];(2)符合改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)擬題的慢性腎病診斷標準[7];(3)年齡>18歲。排除標準:(1)糖尿病、系統性紅斑狼瘡等其他因素導致的繼發性腎病;(2)原發性腎小球腎炎、腎病綜合征或先天性腎臟疾病;(3)惡性腫瘤、消化系統疾病、免疫系統疾病及急慢性感染;(4)血液系統疾病。另隨機選擇同期于本院門診體檢的63例健康志愿者為對照組,已排除先天或繼發性腎病及全身系統性疾病,男34例,女29例,年齡53～77歲,平均(62.41±5.03)歲,兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院倫理會批準,所有受試者對本研究相關事宜知情并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 EasyPure micro RNA Kit購自北京全式金生物技術公司,7500 實時熒光定量聚合鏈反應儀購自美國ABI 公司,AU680全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3方法

1.3.1PEPT1、PEPT2檢測 所有受試者入組后均采集靜脈血5 mL注入促凝管中,取上層液以3 000 r/min 速度離心10 min,收集血清-80 ℃儲存。取血清樣本,室溫復融,EasyPure micro RNA Kit從血清中提取總RNA,通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度、濃度和完整性,選擇吸光度(A)比值A260/A280為1.6～1.8的RNA,采用TransScript?miRNA RT Enzyme Mix、 2×TS miRNA Reaction Mix 對總 RNA 進行逆轉錄。應用實時定量聚合鏈反應檢測PEPT1、PEPT2表達。PCR反應體系如下:cDNA 1 μL,上下游引物0.4 μL,2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL,參比染料(50×) 0.4 μL,最后添加雙蒸水至20.0 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性30 s,94 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個循環。引物序列為PEPT1上游:5′-CTCCCAATGTTCTGGGCCTT-3′;下游:5′-CGTTCACGGTCTGCATCTGA-3′。PEPT2 上游:5′-ATCAGCAGGGTTCACGATGG-3′;下游:5′-CCACACTTGGAGACCAGACG-3′。U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內參,采用2-ΔΔct計算PEPT1、PEPT2相對表達水平。取血清樣本,全自動生化分析儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr),采用腎臟病膳食改良試驗公式計算出估算的腎小球濾過率(eGFR)。

1.3.2隨訪和臨床資料收集 所有高血壓腎病患者出院后均定期電話隨訪和門診定期復查腎功能,隨訪截止2022年7月,記錄ESRD發生情況,ESRD定義為eGFR持續性低于15 mL/(min·1.73 m2),或開始透析或腎移植治療[8]。收集患者年齡、性別、收縮壓、舒張壓、高血壓病程、高血壓腎病病程、合并疾病(冠心病、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病)、降壓治療[血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑(ARNI)]資料。

2 結 果

2.1兩組血清PEPT1、PEPT2和腎功能指標水平比較 高血壓腎病組血清PEPT1、PEPT2相對表達水平和eGFR低于對照組,BUN、SCr 水平高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清PEPT1、PEPT2和腎功能指標水平比較

2.2高血壓腎病患者PEPT1、PEPT2和腎功能指標的相關性分析 高血壓腎病患者血清PEPT1、PEPT2與BUN、SCr呈負相關(P<0.05),與eGFR呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 高血壓腎病患者PEPT1、PEPT2和腎功能指標的相關性分析

2.3影響高血壓腎病進展為ESRD的因素分析 中位隨訪時間為98(30～150)個月,隨訪期間失訪15例,將23例發生ESRD患者作為ESRD組,154例未發生ESRD患者作為NESRD組。ESRD組年齡、收縮壓、舒張壓、高血壓腎病病程、BUN、SCr高于NESRD組,血清PEPT1、PEPT2、eGFR低于NESRD組,差異有統計學意義(P<0.05);兩組性別、高血壓病程、合并疾病、降壓治療比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 影響高血壓腎病進展為ESRD 的單因素分析

2.4影響高血壓腎病進展為ESRD的多因素分析 以收縮壓、高血壓腎病病程、PEPT1、PEPT2、eGFR為自變量(均原值代入),高血壓腎病是否進展為ESRD為因變量(賦值:0=否,1=是),向后逐步法排除無關變量,最終收縮壓、高血壓腎病病程是高血壓腎病進展為ESRD的危險因素(P<0.05),PEPT1、PEPT2、eGFR是保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響高血壓腎病進展為ESRD的Logistic回歸方程

2.5PEPT1、PEPT2預測高血壓腎病進展為ESRD的價值 PEPT1、PEPT2預測高血壓腎病進展為ESRD的ROC曲線下面積(AUC)為0.636、0.714,聯合PEPT1和PEPT2預測高血壓腎病進展為ESRD的AUC為0.897,高于單獨PEPT1、PEPT2(Z=3.680、3.542,P<0.05)。見表5和圖1。

圖1 PEPT1、PEPT2預測高血壓腎病進展為ESRD的ROC曲線

表5 PEPT1、PEPT2預測高血壓腎病進展為ESRD的效能

3 討 論

高血壓是一種慢性心血管疾病,在普通人群中發病率約30%,高血壓腎病是長期高血壓控制不佳的后果之一,傳統觀念認為高血壓腎病是腎硬化和毛細血管玻璃樣變及腎素-血管緊張素系統活性增加導致,隨著分子生物學研究的進展,發現高血壓誘導內皮損傷和缺氧,引發炎癥、上皮-間質轉化和腎小管間質纖維化,繼而引起腎組織廣泛性損傷和腎功能衰竭[9]。血壓升高會加速慢性腎臟病的進展,降壓至目標血壓對延緩慢性腎臟病進展十分重要,但高血壓腎病患者往往血壓控制率偏低,最終導致向ESRD進展[10]。

PEPT1是一種質子寡肽轉運蛋白,屬于質子轉運載體15家族的成員,主要位于小腸上皮細胞的頂膜上,在肝臟、胰腺和結腸等組織中也有表達,PEPT1在二肽、三肽吸收及維持腸道穩態中發揮著至關重要的作用,PEPT1通過介導向內定向的質子電化學梯度誘導小肽流入腸上皮細胞后被吸收,可從膳食蛋白質中消化超過400 種二肽和 8 000種三肽,研究顯示結腸中PEPT1表達缺失會導致腸道微生物群失衡,導致潰瘍性結腸炎和克羅恩病[11]。PEPT1在人類結腸直腸癌、胃癌、纖維肉瘤、肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達上調,并與癌癥增殖生長、惡性進展有關[12]。PEPT1在藥物運輸中也發揮重要作用,作為藥物活性化合物口服吸收的主要途徑,PEPT1通過調節藥物在細胞進出影響藥物的藥代動力學性能[13],提高肽類藥物的生物利用度,例如抗癌劑、β-內酰胺抗菌藥物及治療高血壓的ACEI,藥理研究嘗試開發靶向PEPT1的擬肽藥物,以提高膜通透性,加強藥物吸收度[14]。PEPT1與ACEI具有較高的親和力,ACEI主要通過PEPT1從腸道吸收或從腎臟中再吸收[15]。

PEPT2是另一種質子偶聯肽轉運蛋白,主要在腎近端腎小管細胞頂膜中表達,其功能和底物選擇性方面與 PEPT1 相似并遠高于PEPT1,PEPT2通過促使腎小管中底物重吸收至近端腎小管,負責細胞攝取包括激素、類固醇、毒素等在內的多種物質,影響全身藥代動力學和暴露[16]。PEPT2還可通過腎小管重吸收減少外源性分子的清除,并促使藥物從腦脊液流出到脈絡叢,影響藥物在大腦中的分布、動力學和毒性[17]。PEPT2在調節降壓藥物在腎臟重吸收中起關鍵作用,研究顯示ACEI降壓藥物福辛普利通過 PEPT2以高親和力和質子耦合的可飽和過程完整運輸[18]。本研究結果顯示,PEPT1、PEPT2與高血壓腎病及其向ESRD進展也存在密切關系,高血壓腎病組血清PEPT1、PEPT2相對表達水平低于對照組,高血壓腎病患者血清PEPT1、PEPT2與BUN、SCr呈負相關(P<0.05),與eGFR呈正相關(P<0.05),收縮壓、高血壓腎病病程是高血壓腎病進展為ESRD的危險因素(P<0.05)。PEPT1、PEPT2有望作為高血壓腎病患者ESRD的潛在指標,可為臨床高血壓腎病患者預后預測提供參考,并為臨床治療提供新的靶點和思路。分析原因為ACEI和二肽、三肽類藥物治療高血壓可阻止腎臟惡化的進展并延長壽命,降壓藥物底物在腎臟的重吸收主要由PEPT1 和 PEPT2協同轉運蛋白介導,高血壓可改變PEPT1、PEPT2在腎近端小管中的重新分布,并抑制其表達,影響降壓藥物的重吸收,進而導致血壓控制不良,促使腎臟功能惡化[19]。

本研究回歸分析結果顯示除PEPT1、PEPT2外,收縮壓、高血壓腎病病程、eGFR與高血壓腎病患者ESRD進展也存在密切關系,說明血壓控制不良,高血壓腎病病程延長、腎功能減退是導致ESRD進展的主要原因,提示臨床應重視對高危患者的干預和管理,以延緩ESRD進程,可通過結合除PEPT1、PEPT2外其他高危因素進一步提高對高血壓腎病患者預后分析的效能。ROC曲線分析結果顯示PEPT1、PEPT2預測高血壓腎病患者ESRD進展的AUC為0.636、0.714,高于單獨指標診斷,提示PEPT1、PEPT2可作為預測高血壓腎病患者ESRD進展的生物學標志物,驗證了上述推測,PEPT1、PEPT2可為臨床預防和治療提供參考。

綜上所述,高血壓腎病患者血清PEPT1、PEPT2相對表達水平增高,PEPT1、PEPT2與高血壓腎病患者腎功能減退及ESRD進展有關,PEPT1、PEPT2是高血壓腎病患者預后預測的標志物,并有望成為高血壓腎病治療的潛在靶點。本研究局限性在于未觀察腎組織中PEPT1、PEPT2表達狀態,PEPT1、PEPT2與高血壓腎病腎臟病理特征的關系尚不確定,其次隨訪時間較短,因此以后需進一步延長隨訪,開展基礎研究加以證實。