連翹苷調(diào)節(jié)MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的影響*

王海濱,李 平,張志剛,周萬(wàn)淼

張家口市第二醫(yī)院骨科,河北張家口 075000

膝骨關(guān)節(jié)炎是膝關(guān)節(jié)處發(fā)生的一種慢性退行性疾病,其典型特征為關(guān)節(jié)軟骨降解、肌肉萎縮、關(guān)節(jié)局部炎癥、骨贅形成等,會(huì)引發(fā)患者關(guān)節(jié)僵硬疼痛、變形失用等關(guān)節(jié)功能障礙,嚴(yán)重降低了其生活質(zhì)量,是造成殘疾的主要原因之一[1-2]。膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中促炎細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及軟骨機(jī)制降解退化被認(rèn)為是其主要病理機(jī)制,減輕炎癥與軟骨損傷可明顯延緩膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[3-4]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)作為是重要的炎癥相關(guān)通路可激活下游核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體信號(hào),誘發(fā)炎癥反應(yīng),抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)激活可減輕鎘誘導(dǎo)的腎臟炎癥損傷[5],研究顯示,下調(diào)MAPK/NF-κB通路可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞激活延緩軟骨下骨重塑[6],還可阻止NLRP3炎癥體激活,通過(guò)抗炎和抗氧化作用顯著減輕軟骨侵蝕、細(xì)胞外基質(zhì)降解,進(jìn)而緩解骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[7],因而MAPK/NF-κB/NLRP3可作為防治膝骨關(guān)節(jié)炎的重要靶點(diǎn)。連翹苷是傳統(tǒng)中藥連翹的果實(shí)提取物,現(xiàn)代研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎的生理作用,可降低p38 MAPK磷酸化,抑制牙周炎癥及破骨細(xì)胞活化,減輕牙周炎大鼠牙周組織損傷[8],還可抑制NF-κB信號(hào)活化,減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟組織損傷和基質(zhì)降解[9],但連翹苷是否可通過(guò)抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)激活而減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷,目前還尚未有明確闡釋,本文以連翹苷處理膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型,對(duì)此課題進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,體重200～230 g,雄性,SPF級(jí),購(gòu)于云南生物谷藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(滇)K2018-0009。于維持屏障環(huán)境的動(dòng)物中心飼養(yǎng)房中喂養(yǎng),飼養(yǎng)房?jī)?nèi)溫度維持22～25 ℃,濕度維持55%～65%,照明維持明暗各12 h交替。

1.2儀器與試劑 C16-PAF(MAPK激活劑,純度:99.48%,貨號(hào)HY-108635)購(gòu)自美國(guó)MCE公司;碘乙酸鈉(MIA,純度:98%,貨號(hào)4386-10G)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;連翹苷(純度:HPLC≥98%,貨號(hào)IP0700)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;兔源抗大鼠Anti-Bax一抗(貨號(hào)PA5-11378)購(gòu)自美國(guó)Cell Singaling Technology公司;TUNEL檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)ab206386)、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA,貨號(hào)ab213909)、RIPA裂解液(貨號(hào)ab288006)、大鼠IL-1β ELISA試劑盒(貨號(hào)ab255730)、HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗(貨號(hào)ab97051)、大鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab287802)、兔源抗大鼠Anti-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)3一抗(貨號(hào)ab52915)、兔源抗大鼠Anti-NLRP3一抗(ab232401)、兔源抗大鼠Anti-β-actin一抗(貨號(hào)ab8227)、兔源抗大鼠Anti-MMP9一抗(貨號(hào)ab228402)、兔源抗大鼠Anti-caspase-3一抗(貨號(hào)ab184787)、兔源抗大鼠Anti-p-NF-κB p65一抗(ab239882)、兔源抗大鼠Anti-NF-κB p65一抗(貨號(hào)ab16502)、兔源抗大鼠抗大鼠Anti-p-p38 MAPK一抗(貨號(hào)ab17942)、兔源抗大鼠Anti-p38 MAPK一抗(貨號(hào)ab181602)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。透射電鏡(型號(hào)LVEM25)購(gòu)自美國(guó)Delong Instrument公司;輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(型號(hào)KD202C)購(gòu)自上海特惠儀器設(shè)備有限公司;生物顯微鏡(型號(hào)LW200ET-A)購(gòu)自上海尖端光電科技有限公司;全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)CLARIOstar Plus)購(gòu)自德國(guó)BMG Labtech公司;轉(zhuǎn)移電泳槽(型號(hào)KEEBIO-VE186)、電泳儀(型號(hào)Keebio-miniES)、電泳儀電源(型號(hào)KEEBIO-600N)購(gòu)自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1制備膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型及分組處理 采用經(jīng)典MIA法制備膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型,具體方法參照文獻(xiàn)[10]:將MIA溶解到生理鹽水中制備為20 mg/mL的溶液,取SD大鼠以6 mL/kg的劑量腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉麻醉,將后部右側(cè)膝關(guān)節(jié)附近剔除鼠毛后消毒,于其關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射MIA溶液5 0 μL,5 d后觀察到大鼠雙側(cè)關(guān)節(jié)紅腫,發(fā)生明顯炎癥,提示造模成功,隨機(jī)分為模型組、連翹苷組、C16-PAF組、連翹苷+C16-PAF組,每組10只,另選10只大鼠于其雙側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射生理鹽水50 μL,作為對(duì)照組。

將連翹苷和C16-PAF溶于生理鹽水制為5 mg/mL的連翹苷藥液和4 μmol/L的C16-PAF藥液,連翹苷組大鼠腹腔注射10 mL/kg的連翹苷藥液(劑量達(dá)到50 mg/kg)[11],同時(shí)于其后部右側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射生理鹽水50 μL;C16-PAF組大鼠于其后部右側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射4 μmol/L的C16-PAF藥液50 μL[12],同時(shí)腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水;連翹苷+C16-PAF組大鼠腹腔注射10 mL/kg的連翹苷藥液(劑量達(dá)到50 mg/kg),同時(shí)于其后部右側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射4 μmol/L的C16-PAF藥液50 μL;模型組、對(duì)照組大鼠腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水,同時(shí)于其后部右側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射生理鹽水50 μL,各組大鼠均每天給藥處理1次,處理21 d完成給藥。

1.3.2測(cè)量各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)功能 各組大鼠于建模前使用軟尺測(cè)量大鼠后部同側(cè)膝關(guān)節(jié)周徑(記為r1),21 d給藥完成后24 h,再次測(cè)量其后部同側(cè)膝關(guān)節(jié)周徑(記為r2),關(guān)節(jié)腫脹度計(jì)算公式:關(guān)節(jié)腫脹度=(r2-r1)/r1×100%。采用步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分評(píng)測(cè)大鼠關(guān)節(jié)功能[10],觀察大鼠自由活動(dòng)時(shí)步態(tài)并進(jìn)行評(píng)分:步態(tài)正常且雙足均勻著地,評(píng)0分;輕度跛行且患側(cè)下肢略彎曲,評(píng)1分;中度跛行且患側(cè)下肢剛觸及地面,評(píng)2分;重度跛行且患側(cè)下肢離開地面,評(píng)3分;大鼠放入透明玻璃室(20 cm×25 cm×25 cm)內(nèi),于其下面斜放成45°角的鏡子來(lái)清晰觀察大鼠自由活動(dòng)時(shí)后爪下壓情況并進(jìn)行評(píng)分:兩后爪下壓情況正常,評(píng)0分;患側(cè)后爪下壓輕微減輕,即爪子完全在地板上但腳趾不完全張開,評(píng)1分;患側(cè)后爪下壓情況適度減輕,即部分爪子輕觸地面且爪子彎曲,評(píng)2分;患側(cè)后爪下壓情況嚴(yán)重降低減輕,即爪子完全抬高,評(píng)3分。

1.3.3透射電鏡檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)及采集標(biāo)本 關(guān)節(jié)功能評(píng)測(cè)結(jié)束后,麻醉大鼠(方法見1.3.1),采集其腹動(dòng)脈血離心得到血清,保存在-80 ℃?zhèn)溆?解剖剝出各組大鼠患側(cè)關(guān)節(jié)軟骨,取下大約1/3的組織塊,生理鹽水沖洗后,2%的戊二醛固定24 h后漂洗、1%的四氧化鋨固定2 h后漂洗、(60%、70%、80%、95%、100%)乙醇逐級(jí)脫水、醋酸異戊酯浸泡過(guò)夜、樹脂包埋、固定于超薄切片機(jī)上切片,得到厚約80 nm的切片,放置在載物臺(tái)上,經(jīng)真空噴金后采用掃描電鏡觀察軟骨形態(tài)并攝片;剩余關(guān)節(jié)軟骨組織剪下約0.4 g存在液氮中備用,剩余的組織生理鹽水沖洗、4%的多聚甲醛固定24 h、生理鹽水漂洗、(60%、70%、80%、95%、100%)乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、熱石蠟包埋、固定于輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)上切片,得到厚約4 μm的切片備用。

1.3.4TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 取出1.3.3中厚約4 μm的關(guān)節(jié)軟骨組織切片,二甲苯脫蠟、(100%、95%、80%、70%、60%)乙醇逐級(jí)水化、蒸餾水洗滌后采用TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色,蒸餾水洗滌后采用生物顯微鏡觀察軟骨凋亡情況并攝片,以Image J軟件定量圖片中軟骨凋亡細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)算出軟骨細(xì)胞凋亡率,計(jì)算公式:軟骨細(xì)胞凋亡率=軟骨凋亡細(xì)胞數(shù)/軟骨總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.5ELISA檢測(cè)各組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平 取出1.3.3中存于-80 ℃的各組大鼠血清,冰水浴中解凍后采用ELISA試劑盒測(cè)定其中IL-18、IL-1β、PGE2水平,具體操作參照各自說(shuō)明書指導(dǎo)進(jìn)行。

1.3.6檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織SIRT1/HMGB1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取出1.3.3中存于液氮的各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織,加入RIPA裂解液勻漿提取出其中總蛋白,測(cè)量濃度后每組取15 μg總蛋白煮沸變性,依次進(jìn)行電泳、濕轉(zhuǎn)將其分離后轉(zhuǎn)膜,封閉后剪下NLRP3、β-actin、caspase-3、Bax、MMP3、MMP9、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白,以相應(yīng)的兔源一抗和HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗依次孵育、洗滌,顯色后攝片,采用Image-J分析定量各蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1連翹苷對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)功能的影響 與模型組比較,連翹苷組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分降低(P<0.05),C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分升高(P<0.05);與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分降低(P<0.05)。對(duì)照組無(wú)關(guān)節(jié)腫脹,步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分均為0分。見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分

2.2連翹苷對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨軟骨細(xì)胞形態(tài)完好,胞質(zhì)內(nèi)含有大量線粒體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富且排列整齊。模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)受損:軟骨細(xì)胞線粒體腫脹出現(xiàn)空泡,胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張甚至斷裂溶解、排列雜亂、數(shù)量減少。與模型組相比,連翹苷組大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)形態(tài)有所恢復(fù),受損減輕;C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)形態(tài)受損癥狀加重。與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)形態(tài)受損癥狀減輕。見圖1。

注:A為對(duì)照組,B為模型組,C為連翹苷組,D為C16-PAF組,E為連翹苷+C16-PAF組。

2.3連翹苷對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組[(3.02±0.85)%]相比,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率[(34.41±7.73)%]升高(P<0.05);與模型組相比,連翹苷組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率[(6.07±2.02)%]降低(P<0.05),C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率[(61.58±13.41)%]升高(P<0.05);與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率[(30.13±6.79)%]降低(P<0.05)。見圖2。

注:A為對(duì)照組,B為模型組,C為連翹苷組,D為C16-PAF組,E為連翹苷+C16-PAF組。

2.4連翹苷對(duì)大鼠血清促炎因子IL-18、IL-1β、PGE2水平的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平升高(P<0.05);與模型組相比,連翹苷組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平降低(P<0.05),C16-PAF組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平升高(P<0.05);與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-18、IL-1β、PGE2水平

2.5連翹苷對(duì)大鼠軟骨組織基質(zhì)降解相關(guān)蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,連翹苷組大鼠軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)降低(P<0.05),C16-PAF組大鼠軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3、表3。

注:A為對(duì)照組,B為模型組,C為連翹苷組,D為C16-PAF組,E為連翹苷+C16-PAF組。

表3 各組大鼠軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)

2.6連翹苷對(duì)大鼠軟骨組織MAPK/NF-κB/NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠軟骨組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,連翹苷組大鼠軟骨組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表達(dá)降低(P<0.05),C16-PAF組大鼠軟骨組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與C16-PAF組相比,連翹苷+C16-PAF組大鼠軟骨組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65及NLRP3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4、表4。

注:A為對(duì)照組,B為模型組,C為連翹苷組,D為C16-PAF組,E為連翹苷+C16-PAF組。

表4 各組大鼠軟骨組MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎作為一種中老年人群高發(fā)疾病,隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加深,膝骨關(guān)節(jié)炎已逐漸成為一個(gè)棘手的醫(yī)療問(wèn)題,目前膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療選擇有限,主要是一些甾體類抗炎藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥等,療效受限或不良反應(yīng)大是普遍存在的問(wèn)題,因此尋找開發(fā)新型治療藥物是膝骨關(guān)節(jié)炎臨床研究的重要目標(biāo)[13-14]。本研究采用經(jīng)典MIA法制備膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠血清促炎因子IL-18、IL-1β及PGE2水平明顯升高,觸發(fā)強(qiáng)烈炎癥反應(yīng),引發(fā)大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)受損及軟骨細(xì)胞凋亡,使大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分明顯升高,表明大鼠于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA后,關(guān)節(jié)腫脹且功能受損,提示膝骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功。

膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與促炎因子密切相關(guān),不同促炎因子之間相互影響,觸發(fā)并放大炎癥反應(yīng)可加快膝骨關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展,而降低軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平、炎癥反應(yīng)和凋亡可有效治療膝骨關(guān)節(jié)炎[15-16]。如今中藥在膝骨關(guān)節(jié)炎的治療中逐漸受到重視,連翹苷作為提取自傳統(tǒng)中藥連翹的一種天然抗炎劑,可降低促炎因子表達(dá),有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17],能通過(guò)改善Th17/Treg免疫平衡減輕肺炎克雷伯菌感染的小鼠肺炎癥狀[18],還可通過(guò)抗炎功效緩解骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型軟骨組織損傷[11],本研究以連翹苷處理膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠,發(fā)現(xiàn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)受損減輕,關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分、軟骨細(xì)胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá)降低,表明連翹苷可減少促炎因子合成釋放,阻止炎癥反應(yīng)發(fā)生,降低凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)蛋白表達(dá),抑制軟骨細(xì)胞凋亡和結(jié)構(gòu)損傷,改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹及功能受損癥狀,進(jìn)一步證實(shí)了連翹苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療功效。

MAPK/NF-κB信號(hào)可通過(guò)調(diào)控促炎因子的表達(dá)介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,通過(guò)使其信號(hào)失活從而抑制炎癥的進(jìn)展,并通過(guò)降低MMP3的表達(dá)而減輕軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,最終緩解骨關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨損傷[19],阻斷MAPK/NF-κB信號(hào)從而下調(diào)NLRP3表達(dá),通過(guò)減弱炎癥反應(yīng)而減少軟骨侵蝕,抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎形成及發(fā)展[20],還可減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞衰老、軟骨基質(zhì)降解及關(guān)節(jié)炎癥癥狀[7],蘇娟娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)連翹苷可抑制牙周炎大鼠p38 MAPK信號(hào)活化,進(jìn)而緩解其牙周組織損傷,因而推測(cè)抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)激活可能是連翹苷治療膝骨關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制,本研究結(jié)果顯示,膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)處于激活狀態(tài),連翹苷可使該信號(hào)失活,且以MAPK激活劑C16-PAF處理膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠,可加重其軟骨損傷及關(guān)節(jié)炎癥,表明MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)參與介導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展及連翹苷對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的減輕過(guò)程;以連翹苷和C16-PAF聯(lián)合處理膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠,相比C16-PAF單獨(dú)處理,可降低NLRP3表達(dá)及p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化水平,減輕大鼠關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)受損,降低其關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)評(píng)分和爪壓評(píng)分、軟骨細(xì)胞凋亡率、血清IL-18、IL-1β及PGE2水平、軟骨組織caspase-3、Bax、MMP3、MMP9蛋白表達(dá),表明連翹苷可減弱C16-PAF對(duì)炎癥的促進(jìn)功能,拮抗其對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡和結(jié)構(gòu)損傷的加重作用,最終逆轉(zhuǎn)C16-PAF對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)功能的損害作用,揭示連翹苷減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷是通過(guò)抑制MAPK信號(hào)激活實(shí)現(xiàn)的。

總之,本研究證實(shí)了連翹苷可降低NLRP3表達(dá)及p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化,減少促炎因子合成釋放,抑制炎癥反應(yīng),減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹、軟骨細(xì)胞凋亡及基質(zhì)降解癥狀,改善大鼠關(guān)節(jié)功能,抑制MAPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)激活可能是其藥理機(jī)制之一,本文為連翹苷應(yīng)用于膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供了新的理論依據(jù),有助于其在關(guān)節(jié)炎治療中的推廣應(yīng)用。