海馬鈣蛋白與缺血性腦卒中相關研究

陳永智 朱丹

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應障礙，導致局部組織缺血、缺氧性壞死，而迅速出現相應神經功能缺損的一類臨床綜合征。腦卒中是目前導致人類死亡的第二位原因，腦梗死是卒中最常見的類型，約占70%～80%[1]。腦卒中具有高發病率、高復發率、高致殘率和高死亡率的特點。我國腦卒中現患人數高居世界首位，已成為導致成年居民死亡和殘疾的首位病因，疾病負擔沉重[2]。缺血性腦損傷的病理過程極為復雜，涉及中樞神經系統以及外周循環系統的多種細胞毒性因子和炎癥細胞[3]。氧化應激和神經炎癥是腦缺血再灌注損傷的關鍵病理過程，他們之間的密切互動介導了缺血性腦卒中期間的神經元損傷、血腦屏障損傷等[4]。急性腦缺血和腦損傷是由神經細胞內鈣離子的興奮性升高引起的，隨后是復氧依賴的氧化應激、代謝衰竭和細胞死亡[5]。在細胞急性死亡中，過量的細胞內鈣激活有害的磷脂酶、內切酶和鈣蛋白酶，導致細胞器和細胞膜破裂，主要導致壞死性細胞死亡。而在細胞延遲性死亡中，最開始或較溫和的興奮性毒性可引發一系列細胞功能紊亂，如氧化應激、蛋白質合成或折疊障礙、線粒體功能障礙和細胞信號改變。這些紊亂的積累最終可導致細胞內鈣離子的二次升高和細胞死亡途徑的激活（細胞凋亡、壞死、自噬和壞死性凋亡），最終導致神經元的死亡[6]。海馬鈣蛋白（HPCA）是一種緩沖細胞內Ca2+和防止Ca2+引起細胞死亡的蛋白質，其與細胞內過量的Ca2+結合，在神經元的Ca2+排出中起著重要作用，進而幫助保護神經元免受興奮性毒素損傷[7]。此外，HPCA 通過與神經細胞凋亡抑制蛋白（NAIP）相互作用，對Ca2+誘導的細胞死亡具有保護作用，從而保護受到缺血性損傷的大腦[8]。

1 谷氨酸興奮性毒性與鈣超載

細胞內游離鈣濃度在腦內起著復雜的信號轉導作用。Ca2+跨膜以及細胞內細胞器和細胞間質的流動整合了不同的細胞功能[9]。在缺血性腦損傷過程中，大腦的血液供應中斷會導致氧氣和葡萄糖缺乏，從而減少可用于支持腦細胞的能量[10]。這會導致神經元過度去極化，興奮性神經遞質（谷氨酸）的釋放，谷氨酸蓄積導致突觸后膜谷氨酸受體過度興奮[11]。研究表明，谷氨酸受體家族的幾乎所有成員都參與介導興奮性毒性[12]，親離子受體，如N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體（AMPAR）等被認為是特別重要的。由于興奮性神經遞質從細胞外間隙的重新攝取減少，大量Ca2+通過這些受體及其他方式進入細胞內，導致細胞內鈣超載[13]。胞漿內Ca2+濃度的升高可引發一系列下游神經毒性級聯反應，包括線粒體從ATP 合成過程中的電子傳遞解偶聯，以及鈣調蛋白酶和其他蛋白酶、蛋白激酶、一氧化氮合酶（NOS）、鈣調神經磷酸酶和核酸內切酶等酶的激活和過度刺激，最終引發細胞凋亡和壞死[14]。

2 缺血性損傷與細胞凋亡

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種類型，當細胞處于壓力或遭受不可逆的損傷時，涉及分解代謝酶的激活，信號級聯反應破壞細胞成分[15]。在缺血性損傷發生時，細胞收到死亡信號，促凋亡蛋白移位到線粒體膜上，與其他促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad 和BCL-XS 相互作用。最終可以改變線粒體的通透性，觸發細胞色素c 的釋放，并與凋亡蛋白激活因子-1（APAF-1）結合形成凋亡體。細胞凋亡體的形成激活了半胱天冬酶原-9（proCaspase-9），使其激活成為半胱天冬酶-9（Caspase-9），最終觸發核DNA 降解，從而引起細胞凋亡[16]。此外，配體（如FasL/TNF-α/TRAIL）與死亡受體結合，募集胞質適配蛋白分子，形成死亡誘導信號復合體（DISC），催化proCaspase-8 的分解和自催化激活，從而觸發下游Caspase-3 的裂解，最終也導致細胞凋亡[17]。

3 HPCA 在缺血性損傷中的作用機制

3.1 HPCA 定義HPCA 是一種鈣離子結合蛋白，屬于神經元鈣感受器家族，其參與了廣泛的鈣離子依賴的信號傳遞過程，包括離子通道的調制和運輸、神經遞質的釋放、突觸可塑性、細胞凋亡和基因表達的控制[18]。HPCA 具有3 個EF-Hand 結構（氨基酸序列折疊成一個螺旋-環形-螺旋模式）和1 個位于N 端的肉豆蔻酰化位點，主要在海馬錐體層表達。該序列由195 個氨基酸殘基組成，分子質量約為23kDa，與黏蛋白、恢復素、S-調制素、神經鈣蛋白和神經黏蛋白樣蛋白具有顯著的同源性[19]。HPCA 在亞微摩爾濃度Ca2+水平上1mol 蛋白質結合3mol 的Ca2+，并以鈣依賴的方式與質膜結合。HPCA 在其NH2 端的甘氨酸殘基上發生肉豆蔻酰化，這種修飾是其膜結合特性的關鍵事件[20]。

3.2 HPCA 與興奮性毒性損傷海馬是大腦中最容易受到短暫性缺血和癲癇發作影響的區域，當其受到上述損傷時，細胞外興奮性氨基酸（谷氨酸）水平會急劇升高[21]。持續暴露在興奮性毒性損傷中，大量Ca2+通過谷氨酸受體等方式進入神經細胞中。一項在海馬內注射喹啉酸對小鼠體內海馬神經元影響的實驗表明，HPCA 通過增加神經元中Ca2+的排出來保護海馬神經元免受鈣依賴性損傷[7]。也有研究表明，HPCA 可能以不同的方式解碼谷氨酸受體的激活，將其轉化為對其目標的特定位點和時間的修飾，以保護其免受興奮性毒性損傷[22]。

3.3 HPCA 與細胞凋亡NAIP 通過第三個桿狀病毒抑制重復結構域（BIR3）在Ca2+促進的相互作用中與HPCA 結合，可以在Caspase-3 激活和非激活途徑中保護神經元免受鈣誘導的細胞死亡。兩者在神經細胞中的共同表達具有顯著協同作用[23]。此外也有研究表明，HPCA 參與控制內質網中的Caspase-12 以及由其切割激活的下游通路。Caspase-12 在缺乏HPCA 的神經元中被激活，導致這些細胞抵抗細胞內Ca2+升高的脆弱性增加。同樣Caspase-9 被發現在缺乏海馬鈣素的神經元中被加工[24]，而這些Caspase 在細胞凋亡中起重要作用。

4 HPCA 與相關藥物研究進展

目前為止，許多藥物被證明可以通過影響HPCA 的表達，從而在大腦受到缺血性損傷時保護神經元。首先，褪黑素是一種強大的自由基清除劑和抗氧化劑[25]，由松果體中的L-色氨酸產生[26]。褪黑素可防止氧化應激引起的鈣超載和線粒體膜去極化，阻斷Caspase-3 的激活，從而阻止細胞凋亡[27]。此外褪黑素可調節缺血性腦損傷中小白蛋白和HPCA 的表達，從而參與細胞內鈣水平的調節[28]，在缺血性腦損傷中起到神經保護作用。銀杏葉提取物EGB761 主要由黃酮苷和獨特的萜類內酯組成，在缺血的大腦中表現出抗氧化性能[29]。有研究表明，EGB761 可以減輕腦缺血損傷引起的HPCA 的減少。從而可減輕谷氨酸暴露引起的細胞內Ca2+濃度的升高，因此HPCA 維持參與了EGB的神經保護作用[30]。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是一種酚類化合物和有效的抗氧化劑，具有較強的抗炎活性[31]。同樣，阿魏酸被證實在缺血條件下，維持神經元細胞中HPCA 的表達，阻止了谷氨酸誘導的HPCA 表達下降[32]。而煙酰胺、雌激素、槲皮素同樣在實驗中被證明可降低大腦中動脈大鼠模型的梗死體積，調節缺血性腦損傷中HPCA的表達，從而調節細胞內鈣水平[33～35]。分子氫作為一種新的抗氧化劑，可以選擇性地減少.OH 和ONOO-而不影響生理活性氧。研究表明，富氫水（HRW）可以減弱活性氧的過度產生，保護神經元免受氧化應激[36]，并可以通過調節缺血性腦損傷中鈣緩沖蛋白（特別是小白蛋白和HPCA）的表達來保護神經元，從而維持細胞內Ca2+水平的穩態[37]。7，8-二羥基-4-甲基香豆素（Dhmc）是一種香豆素衍生物，具有特別強的自由基清除能力[38]。Dhmc 抑制谷氨酸誘導的HPCA 的耗竭，通過清除自由基和調節HPCA 表達來預防谷氨酸誘導的毒性[39]，從而保護神經元免受缺血性損傷?，F如今越來越多的藥物被證實通過與HPCA 的相互作用顯示出保護神經細胞的作用，對該類藥物保護機制的深入研究可為神經系統疾病提供新的治療策略及藥物研究靶點。

5 總結

HPCA 是一種鈣結合蛋白，其在鈣超載及谷氨酸誘導的Ca2+水平增加的調節中起到重要作用，同時其與神經細胞凋亡抑制蛋白的相互作用在缺血性損傷中起到保護神經元的作用，以上機制為藥物的研發起到了指導作用。然而，基于目前對缺血性腦卒中發生后神經元損傷和修復的過程認識不夠完善，需要進一步研究以明確HPCA 的表達在腦卒中發作前后如何實現腦保護。了解其在氧化損傷、興奮性毒性、鈣超載中的分子機制，可以為神經元保護提供潛在的治療依據。如何降低缺血性損傷時細胞內Ca2+水平或可成為缺血性腦卒中治療的重要方向。進一步了解HPCA 在缺血性腦卒中發生后Ca2+水平的調節作用及相關機制，為缺血性腦卒中治療的有效性及安全性提供更多新策略。