基于UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS 的扶正抗癌Ⅱ方藥效物質基礎及其干預結腸癌作用機制的網絡藥理學研究*

周敏華，金 軍△，王紅剛，蔡大可，黃曉霞，劉喜娟，余靖華

（1.廣東省中西醫結合醫院，廣東 佛山 528200； 2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006； 3.廣東省第二中醫院·廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東 廣州 510095； 4.廣東省佛山市南海區人民醫院，廣東 佛山 528200）

結腸癌每年造成全球80 萬人過早死亡［1］。中醫認為，結腸癌屬“癥瘕”范疇，是由于正氣虧虛、瘀、毒等在體內郁結而成。已有研究發現，植物中的化學物質等會干擾結腸癌的發生與發展［2］。廣東省佛山市南海區名中醫金軍教授以扶正培本結合消痞散結為治法，自擬扶正抗癌Ⅱ方（FZKAⅡ方）治療結腸癌，由黨參、五爪金龍、白術、茯苓、薏苡仁、法半夏、浙貝母、陳皮、青皮、制仙茅、杜衡、山海螺、菝葜等組方，能有效預防腫瘤的發生與發展，改善癌因性疲乏癥狀［3］。本研究中采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道肼高分辨串聯質譜（UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS）法檢測得到FZKAⅡ方水提液化學成分，并采用網絡藥理學對復方化學成分進行靶點預測及在線數據庫收集疾病靶點，以探討FZKAⅡ方干預結腸癌的作用機制?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：UHPLC - Q - Orbitrap HRMS 型液質聯用系統（美國Thermo Fiser Scientific 公司）；Cubis型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為百萬分之一）；98 - Ⅰ- C型數顯控溫電熱套（湖北泰維科技實業股份有限公司）；KQ-300DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；N-1300 型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

試藥：黨參（批號為20211101），五爪金龍（批號為20211201），白術（批號為20220101），制仙茅（批號為20211201），法半夏（批號為202201228），茯苓（批號為20220101），杜衡（批號為20190601），山海螺（批號為20200701），菝葜（批號為20210601），浙貝母（批號為20220201），薏苡仁（批號為20220101），陳皮（批號為20211101），青皮（批號為C22103003），均購自佛山市中天中藥飲片有限公司；松脂醇二葡萄糖苷對照品（批號為20011401），蘆丁對照品（批號為21010803），齊墩果酸對照品（批號為21031204），綠原酸對照品（批號為21032502），辛弗林對照品（批號為0727 - 200004），均購自成都普菲德生物科技有限公司，含量大于98%；貝母素乙對照品（批號為10751-201110），黨參炔苷對照品（批號為111732 - 201908），阿魏酸對照品（批號為110773 - 201915），茯 苓 酸 對 照 品（ 批 號 為wkq210517054），白術內酯Ⅰ對照品（批號為wkq21050705），均購自四川維克奇生物科技有限公司，含量大于98%；β- 谷甾醇對照品（批號為0851 - 9601），紫丁香苷對照品（批號為111574 - 200603），均購自中國食品藥品檢定研究院，含量大于98%；乙腈（批號為21101121G118），甲酸（批號為C12851411），甲醇（批號為C15443672），均為質譜純，購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 色譜與質譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH Shlield RP18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（1～30 min 時95%A →5%A，5%B →95%B）；流速：0.3 mL/ min；柱溫：40 ℃；進樣量：2μL。

1.2.2 質譜條件

離子源：可加熱式電噴霧離子源（HESI）；檢測方式：正負離子切換模式；噴霧電壓：3 500 V（正離子模式），3 200 V（負離子模式）；輔助氣加熱溫度：320 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；鞘氣體積流速：35 arb；輔助氣體積流速：15 arb；掃描模式：一級質譜［全掃描，質荷比（m/z）100～1 500，質量分辨率為70 000］，動態數據依賴性掃描（二級質譜）。

1.3 中藥復方浸膏制備

取黨參、五爪金龍、白術、制仙茅、法半夏、茯苓、杜衡、山海螺、菝葜、浙貝母、薏苡仁、陳皮、青皮等藥材各適量，分別粉碎成粗粉，置圓底燒瓶中，加蒸餾水（浸過藥面5 cm）浸泡30 min，煎煮2 次，第1 次煮沸后再用文火煎煮30 min，第2 次煮沸后再用文火煎煮25 min，合并藥液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至浸膏，待用。

1.4 溶液制備

取中藥復方浸膏1 g，置25 mL 容量瓶中，加適量80%乙醇使溶解，超聲助溶，0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得中藥復方供試品溶液。分別取松脂醇二葡萄糖苷、蘆丁、齊墩果酸、綠原酸、辛弗林、貝母素乙、茯苓酸、黨參炔苷、蒼術酮、白術內酯Ⅰ、β-谷甾醇、阿魏酸、紫丁香苷對照品各1 mg，精密稱定，分別置5 mL容量瓶中，加50%甲醇使溶解，配制成質量濃度為0.2 mg/mL 的單一對照品貯備液；精密量取1 mL，加50%甲醇稀釋成質量濃度為25μg/mL的混合對照品溶液。

1.5 網絡藥理學分析

成分靶點收集：將篩選出的化學成分的英文名稱輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進行檢索，以口服生物利用度（OB）≥20%、類藥性（DL）≥0.1 為篩選條件，其中TCMSP 數據庫中未找到的化學成分，借助Swiss ADME 平臺（http：//www.swissadme.ch/）進行篩選，以胃腸道吸收（GI absorption）的得分為“high”，DL至少通過2 個“Yes”進行篩選。篩選得到的活性成分逐個輸 入Chemical Book 數 據 庫（https：// www.chemical?book.com/ ProductIndex.aspx）或PubChem 數 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），記錄化合物的SMILES 號或下載化合物的結構，保存為.sdf 文件。在Swiss TargetPrediction 數據庫（http：// www.swisstarget?prediction.ch/）中輸入化合物的SMILES 號或打開.sdf文件，以“Homo sapiens”為限定條件預測成分的作用靶點，并使用PharmMapper 數據庫（http：// www.lilab -ecust.cn/pharmmapper/）補充成分靶點。

疾病靶點收集：以“Colon Cancer”為關鍵詞，分別在DisGeNET 數據庫（https：// www.disgenet.org/）、Gene?Cards數據庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數據庫（https：// omim.org/）中收集結腸癌的疾病靶點，刪除重復靶點，保留與結腸癌相關的靶點。

關鍵靶點篩選：將成分靶點和疾病靶點合并篩選，保留共有靶點，即為FZKAⅡ方干預結腸癌的關鍵靶點。

活性成分- 關鍵靶點- 通路網絡構建：將關鍵靶點輸入String 11.5 數據庫（https：//cn.string-db.org），以“Homosapiens”為篩選條件，構建蛋白互作（PPI）網絡，設定閾值“highestconfidence”> 0.9，其余條件均為默認。使用Cytoscape 3.9.1 軟件構建活性成分- 關鍵靶點-通路網絡。

GO富集分析和KEGG通路富集分析：使用Ensembl數據庫（http：// grch37.ensembl.org/ index.html）將Gene name 轉換為Ensembl ID，使用基迪奧生物信息云平臺（Omicshare，https：//www.omicshare.com/）將關鍵靶點進行基因本體論GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，前者包括GO 生物過程分析（GO Biological Pro?cesses）、GO 分子功能分析（GO Molecular Functions）、GO 細胞組分分析（GO Cellular Components），分析條件均為默認參數，并對所得結果進行可視化。

1.6 分子對接

為進一步分析FZKAⅡ方成分與靶點結合的強度，使用AutoDock Vina v4.2.6 軟件對FZKAⅡ方的成分和靶點分別進行分子對接，以受體和配體的結合能小于- 7 kcal/ mol 為結合作用較好，結合能數值越低，產生相互作用所需的能量就越低［4］。在PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.Gov）中下載化合物的結構，PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）中下載靶點的三維（3D）結構；使用Discovery Studio 4.5 Client 刪除蛋白質靶點的水分子、配體、離子等，保存為.pdb文件；使用AutoDock Vina v4.2.6 軟件對化合物和靶點進行對接，在蛋白質分子上設置中心，并設置X，Y，Z的參數（設置為126）以確保蛋白質被完全覆蓋，為尋找配體分子的最低能量構象以模仿自然體系中的分子穩定構象，進行能量優化，優化次數設置為100［5］，并進行柔性對接；使用PyMOL 2.4.1 軟件對對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 FZKAⅡ方化學成分分析

UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS 正負離子切換模式下檢測，得到FZKAⅡ方水提液質譜總離子流圖（圖1）；通過自建的數據庫、對照品的裂解規律、特征碎片離子、Compound Discover 3.2軟件的分析、文獻［6-20］對化學成分進行鑒定，共鑒定出128 個成分，其中黃酮類35 個，萜類17 個，苯丙素類17 個，木脂素類6 個，酚類9 個，生物堿14 個，有機酸11 個，氨基酸6 個，揮發油1 個，炔類3 個，甾體類1 個，其他8 個。結合網絡藥理學分析結果，與關鍵靶點關聯性較強的29個成分見表1。

表1 FZKAⅡ方水提液中化學成分鑒別結果Tab.1 Identification results of chemical components in FZKA Ⅱwater extract

A.負離子模式 B.正離子模式圖1 FZKAⅡ方水提液質譜總離子流圖A.Negative ion mode B.Positive ion modeFig.1 TIC chromatogram of FZKAⅡwater extract

2.2 網絡藥理學分析

成分靶點與疾病靶點確定：使用Swiss TargetPredic?tion 數據庫及PharmMapper 數據庫對128 個化學成分進行靶點預測，剔除未預測到靶點的29個化學成分；其余99個成分共收集到成分靶點271個，去除重復靶點143個，最終得到128 個成分靶點。使用DisGeNET 數據庫、GeneCard數據庫、OMIM數據庫共收集到疾病靶點933個，去除重復靶點138個，最終得到疾病靶點795個。

關鍵靶點確定：取128 個成分靶點和795 個疾病靶點相互映射，通過繪制維恩圖，獲得FZKAⅡ方干預結腸癌的關鍵靶點33個。詳見圖2。

圖2 FZKAⅡ方治療結腸癌的關鍵靶點維恩圖Fig.2 Venn diagram of the key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

PPI 網絡構建：利用Cytoscape 3.9.1 平臺對String 11.5 數據庫分析結果進行可視化，連線越緊密、顏色越深說明靶點在網絡中越重要，排名前10 的靶點分別為絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、SRC 表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶- 2（MMP - 2）、激酶插入域受體（KDR）、胰島素樣生長因子受體1R（IGF1R）、CCNB1，提示上述靶點可能是FZKAⅡ方治療結腸癌的核心靶點，見圖3。

圖3 FZKAⅡ方治療結腸癌關鍵靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

關鍵靶點的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析：使用Omicshare 平臺對33個關鍵靶點進行GO 富集分析與KEGG 通路富集分析，并對前20 條富集分析結果進行可視化。由圖4A可知，生物過程主要涉及生物質量的調節（GO：0065008）、壓力反應的調節（GO：0080134）、對程序性細胞死亡的調節（GO：0043067）等；分子功能主要涉及離子結合（GO：0043167）、催化活性（GO：0003824）、小分子結合（GO：0036094）等；由圖4B 可知，細胞組成主要涉及質膜區、質膜部分、膜部件等；由圖4C可知，FZKAⅡ方治療結腸癌的通路主要有癌癥通路、人類巨細胞病毒感染、癌癥中的MicroRNAs、癌癥中的蛋白聚糖、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路等。

A.生物過程與分子功能 B.細胞組成 C.KEGG通路富集分析圖4 FZKAⅡ方治療結腸癌的關鍵靶點的GO富集分析與KEGG通路富集分析A.Biological processes and molecular functions B.Cell composition C.KEGG pathway enrichment analysisFig.4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

活性成分-關鍵靶點-通路網絡構建：將PPI網絡篩選出的關鍵靶點與成分靶點相關聯，剔除與關鍵靶點無相互作用的成分，最終得到22 個活性成分與33個關鍵靶點相關，選擇前20個成分并結合前20條通路，構建活性成分-關鍵靶點-通路網絡（圖5）。結果顯示，癌癥通路富集8 個靶點，癌癥中的MicroRNAs 富集6 個靶點，癌癥中的蛋白聚糖富集5 個靶點；其中，與成分、通路關聯性較強的前5 個靶點為糖原合酶激酶3B（GSK3B）、SRC、MMP-9、蛋白酪氨酸激酶2（PTK2）、細胞色素P4501B1（CYP1B1）。

圖5 FZKAⅡ方治療結腸癌的活性成分-關鍵靶點-通路網絡Fig.5 Active ingredients - key targets - pathway network of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

2.3 分子對接結果

槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和關鍵靶點的關聯性較強，故選取以上5 個核心成分分別與關鍵靶點進行對接。由圖6可知，結合能小于-7 kcal/mol的有20 種（83.33%），位于-7～-5 kcal/mol 的有4 種（16.67%）。小于-5 kcal/mol的表示結合活性良好［21］，占100%。選取結合活性強的成分和靶點對接結果進行可視化，結果顯示，FZKAⅡ方的活性成分治療結腸癌具有較好的活性。詳見圖7。

注：黃色“0”表示未對接。圖6 FZKAⅡ方治療結腸癌的核心成分與關鍵靶點對接結果Note：Yellow "0" refers to no molecular docking.Fig.6 Molecular docking results pf key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

A.槲皮素和糖原合酶激酶3B（GSK3B）對接 B.芹菜素和PTGS2 對接 C.木犀草素和MMP - 9 對接 D.山柰酚和多藥耐藥性蛋白1（ABCB1）對接 E.染料木素和雌激素受體2（ESR2）對接注：綠色為化合物，熒光藍為氨基酸殘基，黃色虛線為氫鍵。圖7 FZKAⅡ方治療結腸癌的核心成分與關鍵靶點對接結果的可視化A.Molecular docking of quercetin and GSK3B B.Molecular docking of apigenin and PTGS2 C.Molecular docking of luteolin and MMP - 9 D.Molecular docking of kaempferol and ABCB1 E.Molecular docking of genistein and ESR2Note：Green refers to chemical components，fluorescent blue refers to amino acid residues，and yellow dashed lines refer to hydrogen bonds.Fig.7 Visualization of the molecular docking results between the key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

3 討論

FZKAⅡ方中，黨參、五爪金龍、白術、制仙茅共為君藥，健脾益氣，溫腎壯陽，共同補益先后天之本，扶助正氣；茯苓、薏苡仁、法半夏、浙貝母、杜衡、山海螺和菝葜共為臣藥，利濕導滯，清利腸中濕熱，消痞散結；陳皮、青皮共為佐藥，理氣破氣，補而不滯，抗邪與扶正兼顧。

本研究中通過高分辨質譜技術分析FZKAⅡ方的成分，共鑒定出化學成分128 個，其中黃酮類占比最大（27.34%），表明黃酮可能是FZKAⅡ方的主要活性成分。另有文獻報道，類黃酮的攝入可能通過抗過氧化、抗氧化和抗炎作用而降低結直腸癌的發病率和復發風險；黃酮類化合物還可調節線粒體功能，平衡細菌菌群，促進癌細胞凋亡，通過干擾多種信號轉導途徑，抑制癌細胞的增殖、血管生成及癌細胞的轉移，促進其凋亡等［22-23］。此外，通過網絡藥理學對128個化學成分預測的靶點與結腸癌疾病靶點繪制維恩圖得到33個共同靶點，即為FZKAⅡ方治療結腸癌可能的關鍵靶點。通過與成分、通路相關聯，發現槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和關鍵靶點的關聯性較強，上述成分均來源于五爪金龍，表明五爪金龍可能是治療結腸癌的核心藥材，與方劑組方特點一致。據報道，食用富含槲皮素的洋蔥可降低胃癌、結腸癌、直腸癌的患病風險，尤與結腸癌的發病率呈正相關［24］。山柰酚在多種類型的癌細胞中發揮細胞毒作用，可誘導SW480 人結腸腺癌細胞凋亡，具有潛在的抗癌作用［25-28］。終生攝入染料木素可降低由偶氮甲烷誘導的大鼠結腸癌病變的發生率和頻率［29］。以上研究結果均表明，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚和染料木素等可能是FZKAⅡ方治療結腸癌的主要活性成分，為FZKAⅡ方治療結腸癌的作用物質基礎研究提供了方向。

GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9，PTK2 與成分、通路關聯性較強，表明其可能是FZKAⅡ方干預結腸癌的核心靶點。有研究表明，抑制GSK3B 的表達可進一步抑制腫瘤生長，同時還可誘導結腸癌細胞凋亡［30-31］。SRC基因編碼一種與癌癥相關的非受體酪氨酸激酶SRC 家庭激酶（SFK），SFK 在腫瘤的發展過程中通過影響肌動蛋白、Ras/ 細胞外調節蛋白激酶/ 絲裂原活化蛋白激酶（Ras/ERK/MAPK）途徑，以及EGFR 和血管內皮生長因子（VEGF）受體等在細胞黏附、侵襲、增殖、存活和血管生成中起關鍵作用［32］。MMP-9參與了蛋白激酶C通路的激活，其過表達與乳腺癌和結腸癌患者的生存率下降和癌細胞轉移直接相關［33-34］。與正常組織相比，CYP1B1 mRNA 分別在65%和60%的膀胱和結腸腫瘤中存在過表達現象，且在不同來源的人類結腸癌中檢測到CYP1B1 mRNA 的差異過表達，故CYP1B1 被認為是潛在的腫瘤標志物和癌癥治療的確切靶點［35-39］。槲皮素與CYP1B1 和GSK3B 等同時靶向，且有報道指出，槲皮素的抗癌作用可能是通過其與多種受體的結合，尤其是與芳香烴受體（AhR）的結合。AhR 是一種配體門控轉錄因子，參與調控CYP 1家族的表達，CYP1B1作為CYP1的亞型，其過表達導致CYP1激活［35］，故推測槲皮素可能是干預結腸癌的主要因素之一。以上結果均表明，GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9 可能是FZKAⅡ方治療結腸癌的重要靶點。

GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結果顯示，FZKAⅡ方治療結腸癌與癌細胞中的MicroRNAs、蛋白聚糖、人類巨細胞病毒感染等相關。在惡性腫瘤中，蛋白聚糖可調節癌細胞的表型、耐藥性及腫瘤間質中血管的生成，腫瘤間質的廣泛重塑與蛋白聚糖表達和其結構變異顯著相關［40］。蛋白聚糖在結腸癌中過度表達和分泌，通過與巨噬細胞表面的Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）結合而激活TLR2/4 信號通路，釋放炎性因子白細胞介素1R（IL-1R）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）［41-42］；TLR2/TLR4 信號傳導的啟動促進了癌細胞的生長，下調了細胞凋亡，上調了腫瘤和基質細胞對生長因子和炎癥相關細胞因子的合成［43-45］，表明蛋白聚糖活性具有促癌作用。有研究發現，人類巨細胞病毒感染與結腸癌發生風險顯著相關［46］，結腸癌細胞系感染人類巨細胞病毒后表型顯著改變，與結腸癌細胞增殖和遷移相關的Wnt 信號通路在感染人類巨細胞病毒的細胞中顯著上調［47］。MicroRNAs 在腫瘤發生、發展、血管生成、轉移及化學藥物治療耐藥中顯著相關，MicroRNAs 譜的改變與結腸癌的轉化和癌細胞轉移有關［48］。以上結果均表明，FZKAⅡ方可能通過癌癥通路，癌癥中的MicroRNAs、蛋白聚糖，人類巨細胞病毒感染等信號通路發揮治療結腸癌的作用。

綜上所述，本研究中采用UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS法鑒定出FZKAⅡ方中128個化學成分，其中以黃酮類成分最多，提示黃酮類成分可能是FZKAⅡ方治療結腸癌的主要作用物質基礎；采用網絡藥理學對128個化學成分進行分析，得到GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP-9，PTK2 5 個核心靶點，其可能通過癌癥通路、癌癥中MicroRNAs、癌癥中的蛋白聚糖或人類巨細胞病毒感染等信號通路發揮治療結腸癌的作用，但具體作用機制有待進一步驗證。