利塞膦酸鈉皮膚微透析方法的建立*

梁俊暉，蘇安宇，李亞欣，鄧世森，杜錦顏，王利勝

（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

雙膦酸鹽是目前臨床應用最廣泛的抗骨質(zhì)疏松藥物［1］。美國臨床內(nèi)分泌學家協(xié)會（AACE）和美國內(nèi)分泌學會（TES）制訂的《絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松診斷與治療臨床實踐指南（2020）》指出，大部分高風險骨折患者可首選雙膦酸鹽進行初始治療［2］。雙膦酸鹽的藥品不良反應主要為消化道損傷、腎毒性及眼疾，與其口服及靜脈注射的給藥方式密切相關［3-6］。且口服雙膦酸鹽要求患者空腹并保持30 min 以上的站立或直立坐姿，以減輕藥物對消化道的損傷［7］，這對于骨質(zhì)疏松患者尤其是重癥患者難以完成。因此，如何減少雙膦酸鹽的藥品不良反應，提高患者用藥便利性及依從性，已成為相關從業(yè)人員的研究熱點［8-10］。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)可通過皮膚給藥，避免了傳統(tǒng)給藥方式的首過效應、峰谷現(xiàn)象、依從性差等局限［11］，能很好地解決雙膦酸鹽因口服、注射等方式所致的不良反應問題［12］。目前，已有以壓敏膠、離子配對、透明質(zhì)酸凝膠、微乳、納米粒等進行雙膦酸鹽給藥的研究，生物利用度提升，藥品不良反應發(fā)生率降低［13］。微透析技術(shù)是一種將微灌流取樣與透析技術(shù)相結(jié)合的活體取樣技術(shù)，具有動態(tài)采樣、定量分析、采樣量小、創(chuàng)傷極小的特點［14］，用于經(jīng)皮局部藥物代謝動力學研究中，能最大限度地保護皮膚完整性及活性，在評價藥物滲透性能、藥物代謝動力學及藥物效應動力學方面有獨特優(yōu)勢［15-16］。利塞膦酸鈉為雙膦酸鹽的典型代表藥物，具有強大的抗骨吸收作用及較廣抗骨折譜，已成為臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一線藥物［17-18］。本研究中，通過考察灌流液流速與藥物質(zhì)量濃度對探針體外回收率與損失率的影響，明確利塞膦酸鈉皮膚微透析的可行性，為后續(xù)利塞膦酸鈉的藥物效應動力學評價及雙膦酸鹽類藥物透皮評價模式的選擇提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

K2025 型高效液相色譜儀（山東悟空儀器有限公司）；AUW120D 型電子分析天平（日本Shimadzu 公司，精度為十萬分之一）；90-1型恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器公司）；微透析系統(tǒng)包括MD-1000B型流速控制器，MD-0100型灌注器，MD-1001型灌注器推進泵（美國BAS 公司）；MAB85 雙通道低溫收集器（瑞典MAB 公司）CMA30 型線性探針（瑞典CMA 公司，截留相對分子質(zhì)量為20 000）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；UPTA-20 型超純水機（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；雙通道燒杯（50 mL，四川蜀牛玻璃儀器有限公司）。

1.2 試藥

利塞膦酸鈉對照品（批號為Y17N8C48386，純度為98%），四丁基溴化銨（分析純），無水磷酸二氫鈉（分析純），均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；氫氧化鈉（分析純，滬試國藥集團化學試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司）。所有進入微透析系統(tǒng)的試劑均經(jīng)0.22μm濾膜濾過。

2 方法與結(jié)果

2.1 利塞膦酸鈉含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［19］

色譜柱：ChromCore C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：磷酸二氫鈉緩沖液（含5 mmol/L 磷酸二氫鈉，2 mmol/ L 四丁基溴化銨，1.5 mmol/ L 乙二胺四乙酸二鈉，以4%氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至7.2）-甲醇（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：262 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。理論板數(shù)按利塞膦酸鈉峰計應不低于4 000。

2.1.2 溶液制備

微透析對照品溶液：取利塞膦酸鈉對照品4.80 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用0.9%氯化鈉注射液溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為48.0μg/mL 的微透析對照品母液；精密量取12.5，25.0，50.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，加0.9%氯化鈉注射液定容，制成質(zhì)量濃度分別為6.0，12.0，24.0μg/mL的微透析對照品溶液。

對照品溶液：取利塞膦酸鈉對照品8.00 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動相溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為80.0μg/mL 的高效液相色譜（HPLC）對照品母液。精密量取5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋定容，制成質(zhì)量濃度為40.0 μg/ mL 的對照品溶液。同法逐級稀釋制成質(zhì)量濃度分別為20.0，10.0，5.0，2.5，1.25，0.625μg/mL的系列對照品溶液。

體外透析液及空白透析液：將微透析探針浸入含50 mL 0.9%氯化鈉注射液的雙通道燒杯中，開啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為（200 r/min）］，分別以質(zhì)量濃度為12.0μg/mL 的微透析對照品溶液、0.9%氯化鈉注射液進行灌流，灌流速度為1.0μL/min，開泵平衡60 min后進行收集，即得。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下體外透析液、質(zhì)量濃度為12.0 μg/ mL 的對照品溶液、空白透析液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定。利塞膦酸鈉峰形良好，透析液中其他成分無干擾。色譜圖見圖1。

1.利塞膦酸鈉A.空白透析液 B.對照品溶液 C.體外透析液圖1 高效液相色譜圖1.Risedronate sodiumA.Blank dialysate B.Reference solution C.In vitro dialysateFig.1 HPLC chromatogram

線性關系考察：取2.1.2 項下質(zhì)量濃度分別為80.0，40 .0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.25，0.625 μg/ mL的對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得利塞膦酸鈉回歸方程Y =9.056 7X -2.571 7（r2= 0.999 7，n= 3）。結(jié)果表明，利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在0.625～80.0μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質(zhì)量濃度為40.0μg/mL 的對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果利塞膦酸鈉峰面積的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2 項下質(zhì)量濃度分別為48.0，24.0，12.0 μg/ mL 的微透析對照品溶液，分別于室溫下放置0，12，24，36，48，72 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果利塞膦酸鈉峰面積的RSD分別為0.63%，1.48%，1.72%（n=6），表明微透析對照品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 微透析探針體外回收率和損失率測定［20］

增量法：探針外藥物順濃度梯度透過探針膜進入探針，被0.9%氯化鈉注射液接收，使透析液藥物濃度升高，此過程為藥物的回收?；厥章剩≧）=C透析液/C環(huán)境×100%，其中，C透析液代表透析液中藥物的質(zhì)量濃度，C環(huán)境代表探針外環(huán)境藥物的質(zhì)量濃度。

減量法：灌流液中藥物順濃度梯度透過探針膜擴散到探針外環(huán)境，被外環(huán)境0.9%氯化鈉注射液接收，使透析液藥物質(zhì)量濃度降低，此過程為藥物的損失。損失率（L）=（C灌流液-C透析液）/C灌流液× 100%。其中，C透析液代表透析液中藥物的質(zhì)量濃度，C灌流液代表灌流液中藥物的質(zhì)量濃度。

2.3 灌流液流速與取樣間隔確定

取0.9%氯化鈉注射液50 mL，置雙通道燒杯中，浸入微透析探針，使探針膜居液體中心，用保鮮膜束口以穩(wěn)定瓶內(nèi)環(huán)境，開啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37 ±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min］，以質(zhì)量濃度為12.0μg/mL的微透析對照品溶液為灌流液，在0.5，1.0，2.0，3.0，4.0μL/min 流速下進行灌注，開泵平衡60 min 后收集不同流速下的透析液，每次收集40μL，每個流速收集3個樣品，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，計算探針體外損失率。體外微透析試驗裝置示意圖見圖2。同法，將微透析探針浸于質(zhì)量濃度為12.0 μg/ mL 的微透析對照品溶液中，以0.9%氯化鈉注射液為灌流液，在不同流速下灌注并進樣測定，計算探針體外回收率。

由表1 可知，流速在0.5～4.0 μL/ min 范圍內(nèi)，利塞膦酸鈉的探針體外回收率隨著流速加快呈類線性下降，當流速為0.5 μL/min 時體外回收率最大（59.76 ±1.85）%。探針存在較固定的誤差范圍［21］，選擇回收率較高的流速能在一定程度上保證試驗的準確性。但過慢的流速會導致取樣時間延長，潛在的探針免疫排斥現(xiàn)象同樣會干擾試驗的準確性［22］，且試驗效率低下［23］。綜合考慮，確定灌流速度為1.0μL/min，取樣間隔為40 min，此條件下利塞膦酸鈉的探針體外回收率為（45.85±0.63）%。且同一流速下利塞膦酸鈉的探針體外回收率與損失率相當（RSD=1.82%），表明反透析法可應用于利塞膦酸鈉探針體內(nèi)回收率的計算。

表1 灌流液不同流速對探針體外回收率和損失率的影響（%，n=3）Tab.1 Effect of different flow rates of perfusion fluid on the in vitro recovery rates and loss rates of the probe（%，n=3）

2.4 灌流液質(zhì)量濃度確定

取0.9%氯化鈉注射液50 mL，置雙通道燒杯中，浸入微透析探針，使探針膜居于液體中心，用保鮮膜束口以穩(wěn)定瓶內(nèi)環(huán)境，開啟恒溫磁力攪拌器［溫度為（37 ±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/ min］，以2.1.2 項下質(zhì)量濃度分別為6.0，12.0，24.0，48.0 μg/ mL 的微透析對照品溶液為灌流液，在1.0 μL/ min 的流速下進行灌注，開泵平衡60 min 后收集不同灌流液濃度下的透析液，每次收集40μL，每個濃度收集3 個樣品，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，計算探針體外損失率。同法，將微透析探針浸于4組不同質(zhì)量濃度的微透析對照品溶液中，以0.9%氯化鈉注射液為灌流液進行灌注并進樣測定，計算探針體外回收率。

由表2 可知，質(zhì)量濃度在6.0～48.0 μg/ mL 范圍內(nèi)，利塞膦酸鈉的探針體外回收率基本一致，相同質(zhì)量濃度下利塞膦酸鈉的探針體外回收率與損失率相當，表明質(zhì)量濃度在6.0～48.0μg/mL 范圍內(nèi)的變化對探針體外回收率影響不顯著，提示反透析法可應用于利塞膦酸鈉體內(nèi)回收率的計算。

表2 灌流液不同質(zhì)量濃度對探針體外回收率和損失率的影響（%，n=3）Tab.2 Effect of different mass concentrations of perfusion fluid on the in vitro recovery rates and loss rates of the probe（%，n=3）

3 討論

雙膦酸鹽類藥物受限于自身較大的分子量及較差的脂溶性，難以依靠細胞轉(zhuǎn)運的方式吸收，導致口服生物利用度較差。同時多數(shù)雙膦酸鹽類藥物帶有負電荷，形成的電離屏障使小腸吸收更困難［24］。此外，有關使用雙膦酸鹽類藥物引起腎毒性［25］及眼毒性［26-27］等藥品不良反應早已報道，但受限于醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的滯后，一直未找到更好的解決方式。2000 年，RAMACHANDRAN等［28］將雙膦酸鹽做成油包水型微乳進行經(jīng)皮給藥，雖然受試動物出現(xiàn)了輕微的皮膚刺激反應。目前，針對高分子水溶性物質(zhì)經(jīng)皮給藥難以透過角質(zhì)屏障的問題，出現(xiàn)了以微針給藥、離子導入、超聲導入為代表的多種解決方案，這些新型經(jīng)皮給藥技術(shù)不僅能使藥物有與注射給藥一樣良好的生物利用度，且解決了傳統(tǒng)注射及口服給藥依從性差的問題［29］。

雙膦酸鹽類藥物利塞膦酸鈉具有較強的親水性，且分子量相對較大，難以通過傳統(tǒng)經(jīng)皮給藥方式通過角質(zhì)屏障進入人體循環(huán)［30］，不僅阻礙了雙膦酸鹽類藥物的經(jīng)皮給藥劑型開發(fā)，同時也無法通過體外透皮試驗對該類制劑進行評價。微透析探針膜因其纖維材料與皮膚結(jié)構(gòu)可區(qū)分，特別適用于水溶性成分及小分子化合物的采集［31］，可考慮用于雙膦酸鹽類藥物新型經(jīng)皮給藥制劑的皮膚滲透性評價。

本研究中通過考察灌流液流速與藥物質(zhì)量濃度對探針體外回收率與損失率的影響，建立了利塞膦酸鈉皮膚微透析方法。結(jié)果顯示，在1.0 μL/ min 的流速下具有較好的回收率，且取樣間隔科學、合理，此時利塞膦酸鈉探針體外回收率為（45.85±0.63）%，與損失率基本一致（RSD= 1.82%）；利塞膦酸鈉質(zhì)量濃度在6.0～48.0 μg/ mL 范圍內(nèi)的探針體外回收率基本一致，表明微透析方法用于評價利塞膦酸鈉經(jīng)皮局部給藥的藥物效應動力學可行。