云南重樓果皮高效液相色譜指紋圖譜研究

蘇會梅，陸禮和，余 麗，徐宏盼，萬近福，△

（1.昆明醫科大學藥學院·云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500； 2.云南省藥物研究所·云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111）

云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.為百合科重樓屬植物，收載于歷版《中國藥典（一部）》，并規定以干燥根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效［1］。重樓地上部位一年一生資源豐富，但常大量丟棄，造成浪費。不少學者對其開展了化學成分和藥理活性［2-7］研究，發現皂苷類成分為主要活性成分［8］。劉佳等［9-10］比較了同種重樓不同部位（葉片、地上莖、種子、果皮、外種皮）、不同種重樓不同部位中重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的含量，發現含量相差較大，不同部位均含有重樓皂苷Ⅶ，含量依次為果皮> 外種皮> 葉片> 種子> 地上莖；僅果皮和葉片含有重樓皂苷Ⅰ，且葉片>果皮。李燕敏等［11］采用超高效液相色譜- 四極桿- 飛行時間串聯質譜（UPLC -QTOF - MS/ MS）法結合高效液相色譜（HPLC）法對華重樓根莖、須根、莖、葉、種子、果皮的化學成分進行分析，發現根莖、須根、種子的化學成分相似，均以偏諾皂苷為主；果皮同時含有偏諾皂苷和薯蕷皂苷，以偏諾皂苷含量居高，主要為重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H。為更好地開發和利用云南重樓果皮，本研究中建立了云南重樓果皮化學成分的HPLC 指紋圖譜［12-15］，旨在為云南重樓果皮的質量控制及合理開發提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate3000 型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），配有LC-20AT型四元泵、SIL-20A型自動進樣儀、CTO-20A 型柱溫箱、SPDM-20A 型紫外檢測器；XSE205 型電子天平（精度為0.01 mg），ME 204T/02型電子天平（精度為0.01 mg），均購自梅特勒-托利多儀器< 上海> 有限公司；DZKW - S - 6 型智能數顯恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器預先責任公司）；ADVANTAGA10型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

云南重樓果皮由云南白藥集團太安中藥材生產質量管理規范（GAP）種植基地提供，經云南省藥物研究所蘇鈦正高級工程師鑒定為正品，批號分別為20221028-4（S1，4 年生）、20221028 - 5（S2，5 年生）、20221028 - 6（S3，6 年生）、20221028-M（S4，多年生）、20221028-7（S5，5 mm圓）、20221028-8（S6，5 mm長）、20221028-9（S7，3～5 mm 圓）、20221028 - 10（S8，3～5 mm 長）、20201109（S9）；重樓皂苷Ⅰ對照品（批號為111590 -202105），重樓皂苷Ⅱ對照品（批號為111591 -20210504），重樓皂苷Ⅵ對照品（批號為111592 -201604），重樓皂苷Ⅶ對照品（批號為111593 -202105），均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于96.0%；重樓皂苷Ⅲ對照品、重樓皂苷D對照品、重樓皂苷H 對照品、kaempferol - 3 -O-β-D- galactopy?ranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（CLD02）對照品、isorhamnetin - 3 -O-β-D- galactopyranosyl -（1 →6）-β-D- glucopyranoside（CLD03）對照品、異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷（CLD04）對照品、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（CLD01）對照品均為實驗室自制，經核磁、質譜數據及文獻對比后確定其結構，HPLC 檢測質量分數均大于95.0%；乙腈（美國Merck公司，色譜純）；超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～60 min 時10%A～50%A，60～65 min 時50%A～80%A，65～85 min 時80%A～90%A，85～95 min 時90%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：15μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H對照品各適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.415，0.571，0.525，0.419，0.463，0.416，0.494 mg/mL 的重樓皂苷混合對照品溶液。分別取CLD02，CLD03，CLD04對照品各適量，加水制成質量濃度分別為4.16，4.32，3.86 mg/mL 的CLD 混合對照品溶液。取CLD01對照品適量，加甲醇制成質量濃度為1.52 mg/ mL 的對照品溶液。

供試品溶液：取藥材樣品粉末（過3 號篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質量，80 ℃恒溫水浴鍋中加熱回流60 min，放冷，再次稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL；回收溶劑至干，殘渣加水10 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取5次，每次15 mL，合并正丁醇液，蒸干；殘渣用5 mL甲醇溶解，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察［16］

精密度試驗：參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0512 HPLC 法，取藥材樣品（批號為20201109）粉末1.0 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖，以重樓皂苷Ⅶ峰為參照峰。結果各共有峰相對峰面積的RSD小于1.98%（n= 6），相對保留時間的RSD小于0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：參照2020 年版《中國藥典（四部）》9101 藥品質量標準分析方法驗證指導原則，取藥材樣品（批號為20201109）粉末1.0 g，共6 份，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰。結果各共有峰相對峰面積的RSD小于2.04%（n=6），相對保留時間的RSD小于0.42%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：參照2020 年版《中國藥典（四部）》9101 藥品質量標準分析方法驗證指導原則，取藥材樣品（批號為20201109）粉末1.0 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以重樓皂苷Ⅶ為參照峰。結果各共有峰相對峰面積的RSD小于1.54%（n=7），相對保留時間的RSD小于0.39%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取藥材樣品（批號為20201109）粉末0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷Ⅱ對照品5.280 0 mg 和2.206 0 mg，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ的平均加樣回收率分別為106.11%和102.45%，RSD分別為0.53%和1.10%（n=6），表明結果準確度好。

2.4 指紋圖譜建立與相似度評價

取9 批藥材樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版，以藥材樣品S1 的色譜圖為參照譜圖，采用中位數法生成對照譜圖，時間窗寬度設置為0.1 min，匹配方法為多點校正法，建立共有模式，共標記16 個共有峰，并生成指紋圖譜，見圖1和圖2。

圖1 9批藥材樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of nine batches of Paridis Pericarpium

圖2 藥材樣品高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Paridis Pericarpium

8 號峰為重樓屬植物的特征標志峰（重樓皂苷Ⅶ），峰面積較大且與其他相鄰峰分離度良好，故定為參照峰（S）。計算其他共有峰的相對峰面積和相對保留時間，各共有峰相對峰面積的RSD均不低于22.21%，各共有峰相對保留時間的RSD均不超過0.62%，詳見表1。9 批藥材樣品的HPLC 指紋圖譜相似度評價結果見表2。

表1 9批藥材樣品高效液相色譜共有峰的相對峰面積和相對保留時間Tab.1 Relative peak areas of common peaks in the HPLC chromatograms of nine batches of Paridis Pericarpium

表2 9批藥材樣品相似度評價結果Tab.2 Results of similarity evaluation of nine batches of Paridis Pericarpium

2.5 特征峰歸屬和指認

取2.2 項下供試品溶液及對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。共指認9個成分，包括4 個黃酮類成分及5 個重樓皂苷類成分，分別為kaemp?ferol- 3 -O-β-D- galactopyranosyl-（1 →6）-β-D- glucopyranoside（峰2）、isorhamnetin-3-O-β-Dgalactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside（峰3）、異鼠李素-3-O-β-D-龍膽二糖苷（峰4）、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（峰5）、重樓皂苷Ⅶ（峰8）、重樓皂苷D（峰9）、重樓皂苷H（峰10）、重樓皂苷Ⅲ（峰12）、重樓皂苷Ⅰ（峰13）。詳見圖3。

A.重樓皂苷混合對照品溶液 B.CLD01對照品溶液C1- C3.CLD混合對照品溶液（CLD02，CLD03，CLD04）2.Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-Dglucopyranoside 3.Isorhamnetin-3-O-β-D-galactopyrano?syl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside 4.異鼠李素-3-Oβ -D-龍膽二糖苷 5.異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷8.重樓皂苷Ⅶ 9.重樓皂苷D 10.重樓皂苷H 12.重樓皂苷Ⅲ13.重樓皂苷Ⅰ 17.重樓皂苷Ⅱ 18.重樓皂苷Ⅳ圖3 對照品溶液高效液相色譜圖A.Mixed reference substance of polyphyllin B.CLD01 reference solu?tion C1-C3.CLD reference solution（CLD01，CLD03，CLD04）2.Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glu?copyranoside 3.Isorhamnetin-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside 4.Isorhamnetin-3-O-β-D-gentiano?side 5.Isorhamnetin 3-O-β-D-glucoside 8.Polyphyllin Ⅶ9.Polyphyllin D 10.Polyphyllin H 12.Polyphyllin Ⅲ 13.Polyphyllin Ⅰ17.Polyphyllin Ⅱ 18.Polyphyllin ⅣFig.3 HPLC chromatograms

3 討論

3.1 色譜條件優化

預試驗中參照2020年版《中國藥典（一部）》重樓含量測定項下相關要求，對不同流動相（甲醇- 水、乙腈-水、甲醇- 0.1%磷酸水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液），不同色譜柱［Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、YMC J'sphere ODS-H80 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Xtimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Zorbax SB - Aq 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Ecosil HPLC Column 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］，不 同 流 速（0.9，1.0，1.1 mL/min），不同溫度（28，30，32 ℃）進行了考察，采用梯度洗脫，對色譜條件進行優化，發現洗脫系統為乙腈- 水，流速為1.0 mL/ min，色譜柱為Capcell PAK C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）時各成分分離效果好，峰形好；溫度對分離效果影響不大，基于實驗室常用柱溫，故選定柱溫為30 ℃；通過對供試品溶液進行180～500 nm 波長范圍內掃描，發現各成分于203 nm波長處出峰較多，故選定檢測波長為203 nm。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

對不同提取方式（超聲提取、回流提取），提取溶劑（50%，75%，100%，50%，75%，95%乙醇），提取時間（30，60，120 min），提取液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，50∶1，100∶1，mL/g）進行考察，以重樓皂苷Ⅶ的峰面積和峰形作為判斷依據。結果表明，50倍75%甲醇回流提取60 min效果最佳。

3.3 指紋圖譜相似度評價

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0 版對9 批藥材樣品進行分析，共確定了16 個共有峰，相似度為0.903～0.980，各共有峰相對保留時間的RSD均不超過0.62%，表明HPLC 指紋圖譜體系穩定，可為云南重樓果皮的質量控制提供參考。但相對峰面積的RSD相差較大，為排除試驗誤差，在此基礎上補充了重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ的加樣回收試驗，結果平均加樣回收率分別為106.11%和102.45%，RSD分別為0.53%和1.10%，提示不同批次、不同采收年限的云南重樓果皮品質存在較大差異。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法精密度高、重復性好、穩定性強，能較好地反映云南重樓果皮中化學成分的HPLC 指紋圖譜，可為云南重樓果皮的整體質量控制和評價提供參考。