高效液相色譜-高分辨四極桿-飛行時間-質譜法測定中成藥中非法添加物二乙氨基前他達拉非*

舒 展，王琤帥，應斌斌，金 芩，陳 旦

（浙江省金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000）

中成藥中常非法添加化學藥物，以磷酸二酯酶Ⅴ型抑制劑（PDE5i）為例，由于功能特殊，利潤巨大，作為非法添加物的現象尤為嚴重［1-3］。目前，補充檢驗方法BJS201805規定了90種那非類的物質的檢驗方法［4］，但在日常檢驗工作中發現此標準規定范圍外的、通過結構修飾得到的新型PDE5i［5-9］。非法添加物二乙氨基前他達拉非是一種他達拉非的結構衍生物［10-11］，尚缺乏高分辨質譜的定性定量研究。為此，本研究中采用高效液相色譜-高分辨四極桿-飛行時間-質譜（HPLCQ-TOF-MS）法對中成藥中的二乙氨基前他達拉非進行分析方法的研究，同時利用高分辨質譜對裂解規律進行總結，可用于他達拉非系列衍生物的非目標化合物的篩查。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 6530 型HPLC - QTOF 液質聯用儀（美國Agilent 公司），配有Mass Hunter B04.00 軟件；XS205DU型電子天平（瑞士Mettler 公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；Direct - Q 5UV 型超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

二乙氨基前他達拉非對照品（批號520043 -201401，含量99.7%），他達拉非對照品（批號510170 -202102，含量99.8%），氨基他達拉非對照品（批號520042 - 202002，含量99.5%），均購于中國食品藥品檢定研究院；N-去甲基他達拉非對照品（多倫多研究化學公司，批號19-MVI-126-1，含量99.8%）；乙腈（色譜純，美國霍尼韋爾公司，批號EC943 - CN）；冰醋酸（色譜純，德國Merck 公司，批號Z0763908147）；樣品均為抽檢樣品（批號分別為A363632，20210509，ST11220，BN00701，20210315）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EC - C18柱（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸溶液（B），梯度洗 脫（0～15 min 時10%A～40%A，15～20 min 時40%A～90%A，20～30 min 時90%A，30～31 min 時10%A，31～40 min時10%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1μL。

2.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；質荷比（m/z）掃描范圍：50～1 000；霧化氣（N2）壓力：35 psi；干燥氣（N2）流速：12L/min；溫度：350℃；毛細管電壓：3.5kV；碎裂電壓：180 V；二級質譜碰撞裂解能量：30 eV。

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取二乙胺基前他達拉非對照品10.52 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加50%乙腈適量，超聲使溶解并定容，搖勻，即得。

混合對照品溶液：取二乙氨基他達拉非10.12 mg，氨基他達拉非10.03 mg，N-去甲基他達拉非10.22 mg，他達拉非10.11 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，搖勻，用50%乙腈稀釋，得質量濃度為1 mg/mL的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品1.0 g，置100 mL 容量瓶中，用50%乙腈超聲溶解并定容，精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，用50%乙腈定容，即得。

2.3 質譜行為分析

取2.2項下對照品貯備液，用50%乙腈稀釋成質量濃度為1.05μg/mL 的對照品溶液，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定。由于二乙氨基前他達拉非結構中存在N，易與H+結合形成［M + H］+準分子離子，與加鈉分子離子峰［M + Na］+比較，［M + H］+的豐度更高（圖1）。故在實際樣品測定中，選擇［M+H］+為母離子進行定量分析。

圖1 二乙氨基前他達拉非一級質譜圖Fig.1 The first order mass spectrum of diethylaminopretadalafil

2.4 定量分析

采用Agilent Mass Hunter B04.00 軟件按精確相對分子質量464.218 0 提取離子色譜圖進行定量分析。提取質量窗口為10×10-6。

2.5 二乙氨基前他達拉非裂解規律推測

通過二乙氨基前他達拉非的二級質譜圖（圖2）推測可能的裂解途徑（圖3）。裂解途徑1：哌啶環上的C—N鍵發生斷裂形成m/z為334.107 4 的碎片離子，進一步脫去甲氧酰基形成m/z為274.086 3 的碎片離子。裂解途徑2：通過反Diels-Alder 反應得到m/z為262.086 3的碎片離子，此碎片離子最終形成m/z為135.044 1 的碎片離子［12］。

圖2 二乙氨基前他達拉非二級質譜圖Fig.2 The second order mass spectrum of diethylaminopretadalafil

圖3 二乙氨基前甲基他達拉非的裂解途徑及主要碎片離子Fig.3 Pyrolysis pathway and main fragmentation of diethylamino?pretadalafil

2.6 二乙氨基前他達拉非方法學考察

線性關系考察與檢測限、定量限確定：取2.2 項下對照品貯備液，用50%乙腈稀釋成質量濃度分別為0.11，0.53，1.05，2.10，5.26 μg/ mL 的系列對照品溶液，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定，以母離子峰面積（Y）對二乙氨基前他達拉非質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y= 13 816 134X+ 4 257 269（r=0.997 0，n=5）。結果表明，二乙氨基前他達拉非質量濃度在0.11～5.26 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。取對照品貯備液，用50%乙腈稀釋后，按2.1項下色譜與質譜條進樣測定，以信噪比（S/N）分別為3∶1和10∶1的質量濃度為檢測限和定量限。結果檢測限為0.021μg/mL，定量限為0.053μg/mL。

精密度試驗：取線性關系考察項下對照品溶液（質量濃度為1.05 μg/mL）適量，按2.1 項下色譜、質譜條件連續進樣測定5 次，以峰面積計算精密度。結果的RSD為3.52%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取線性關系考察項下對照品溶液（質量濃度為1.05 μg/ mL）適量，分別于0，2，4，8，12 h 時按2.1項下色譜與質譜條件進樣測定母離子峰面積。結果的RSD為4.56%（n= 5），表明對照品溶液在12 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為A363632），依法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄母離子峰面積。結果的RSD為2.33%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取未檢出二乙氨基前他達拉非的陰性片劑粉末1 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，分別精密加入對照品溶液（質量濃度為105.2μg/mL）0.8，1.0，1.2 mL，用50%乙腈定容，每個濃度平行制備3份，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 二乙氨基前他達拉非加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of diethylaminopretadalafil（n=9）

2.7 樣品含量測定

取樣品（批號為A363632），依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜與質譜條件進樣測定，得到與對照品保留時間相同的提取離子流色譜峰（圖4），其準分子離子峰［M +H］+m/z為464.217 6（理論m/z為464.218 0，Δm= -0.8×10-6），與二級質譜圖一致（圖5）。結果測定含量為3.58 mg/g。

圖4 供試品溶液提取離子色譜圖Fig.4 Extraction ion chromatogram of the test solution

圖5 供試品溶液與對照品溶液二級質譜圖Fig.5 The second order mass spectrum of the test solution and the reference solution

2.8 他達拉非類化合物裂解規律比較

通過比較他達拉非、氨基他達拉非和N-去甲基他達拉非的裂解規律［13-14］發現，他達拉非類化合物均具有m/z為135.044 1 的特征碎片離子（圖6），其原因為此類物質具有胡椒環結構［15］。實際工作中，可根據這一特征離子快速篩查他達拉非類化合物，再根據裂解規律推測化合物的結構，在結構信息未知的情況下實現物質結構的推測。

A.二乙氨基前他達拉非 B.氨基他達拉非 C.N - 去甲基他達拉非 D.他達拉非圖6 他達拉非類化合物二級質譜圖1.Diethylaminopretadalafil 2.Animotadalafil 3.Nortadalafil 4.TadalafilFig.6 The second order mass spectrum of tadalafil derivatives

2.9 基于特征離子的他達拉非類化合物篩查

取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜與質譜條件，以auto MS/ MS 模式進行掃描，采用Mass Hunter 軟件，按精確相對分子質量135.044 1 處二級質譜提取離子色譜圖（圖7），快速識別他達拉非類化合物，根據裂解規律推測出二乙氨基前他達拉非、他達拉非、氨基他達拉非、N-去甲基他達拉非等。

1.二乙氨基前他達拉非 2.氨基他達拉非 3.N - 去甲基他達拉非 4.他達拉非圖7 混合對照品溶液在m/z為135.044 1處的二級質譜提取離子色譜圖1.Diethylaminopretadalafil 2.Animotadalafil 3.Nortadalafil 4.TadalafilFig.7 Extraction ion chromatogram of mixed reference solution at m/z of 135.044 1

3 討論

3.1 流動相選擇

曾考察水-乙腈、10 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈、0.1%乙酸溶液- 乙腈流動相體系對分離效果及質譜靈敏度的影響。結果采用0.1%乙酸溶液-乙腈流動相體系不僅具有較好的峰形，且具有較高的質譜響應。故選擇0.1%乙酸溶液-乙腈作為流動相。

3.2 毛細管出口電壓優化

隨著毛細管出口電壓的增加，二乙氨基前他達拉非的［M + H］+離子響應逐漸增加，但隨后發生源內裂解，離子響應逐漸減小。采用100～200 V 的毛細管出口電壓測定（每隔10 V增加1次），結果毛細管出口電壓設定為160 V時［M+H］+離子具有最高響應值。

3.3 碰撞裂解能優化

他達拉非類化合物在碰撞裂解的條件下易產生碎片離子。采用10，20，30，40 eV 的碰撞裂解能對二乙氨基前他達拉非進行裂解。結果碰撞裂解能為30 eV 時裂解碎片細節最豐富，有利于裂解途徑的歸納和鑒別測定。故碰撞裂解能設定為30 eV。

3.4 方法評價

二乙氨基前他達拉非作為一種新型的PDE5i，目前報道的檢測方法較少。本研究中采用HPLC 作為分離手段，以Q - TOF - MS 檢測器作為檢測手段，定性可靠。特別是通過對他達拉非類化合物裂解規律的總結，利用藥物構效關系設計的原理，發現此類物質特征碎片離子。利用特征碎片離子能有效發現他達拉非類化合物，為非法添加物的檢測提供了新思路，從靶向目標化合物的篩查轉向了非靶向、非目標化合物的篩查，為市場監管提供技術支撐，保障患者用藥的安全。