基于高效液相色譜指紋圖譜及多指標成分分析的化學計量學評價活血消痛酊質量

李 菲

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院，福建 福州 350000）

活血消痛酊是由當歸、川芎、丹參、白芍、白芷、紅花、丁香、肉桂等15 味中藥材加工制成的醫院制劑，具有活血止痛、舒筋活絡功效，臨床外用于治療跌打損傷、氣滯血瘀所致肢體疼痛。現行質量標準收載于《福建省醫院制劑規程》［1］，但僅對當歸、川芎、白芍3 味中藥材進行薄層色譜鑒別及酊劑項下的常規檢查，并無含量測定，不能全面、準確地評價其質量。目前，未見文獻報道活血消痛酊質量控制研究。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）波長切換法測定阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素8 種成分的含量，并結合化學計量學評價活血消痛酊的整體質量，為進一步完善其質量標準提供理論依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；CPA225D 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

活血消痛酊（醫院制劑，規格為每瓶40 mL，編號為S1 - S10，批號分別為20190217，20190521，20190611，20200906，20201019，20201125，20210608，20210917，20211027，2021115）；阿魏酸對照品（批號110773 -202015，含量以99.1%計），芍藥苷對照品（批號110736-202143，含量以95.7%計），丹酚酸B 對照品（批號111562-202017，含量以96.8%計），丹參酮ⅡA對照品（批號110766-202021，含量以99.0%計），羥基紅花黃色素A 對照品（批號111637 - 202110，含量以95.1%計），山柰素對照品（批號110861 - 202113，含量以93.7%計），歐前胡素對照品（批號110826-202018，含量以99.2%計），異歐前胡素對照品（批號110827 -202112，含量以99.3%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［2-4］

色譜柱：Waters Sunfire ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.15%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～16 min 時18%A，16～28 min 時18%A →36%A，28～40 min 時36%A →83%A，40～48 min 時83%A →65%A，48～58 min 時65%A →55%A，58～64 min 時55%A →18%A）；檢測波長：230 nm（0～30 min 時檢測阿魏酸和芍藥苷），403 nm（30～36 min時檢測羥基紅花黃色素A），280 nm（36～48 min時檢測丹參酮ⅡA和丹酚酸B）、254 nm（48～64 min 時檢測歐前胡素和異歐前胡素）；流速：0.95 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為2.078 3，1.201 7，1.625 4，1.216 8，3.716 6，0.558 9，0.605 7，0.636 2 mg/mL 的混合對照品溶液，避光保存。

供試品溶液：取活血消痛酊3 瓶，混勻，精密量取10 mL，置50 mL 棕色容量瓶中，加65%甲醇30 mL，室溫超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）45 min，取出，再用65%甲醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續濾液，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液：按活血消痛酊的制備工藝分別制備缺丹參、紅花、白芍、白芷、當歸和川芎的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號為S8），依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，以12 號峰（羥基紅花黃色素A）為參照峰，測得其余21 個共有峰相對保留時間的RSD在0.77%～1.03%（n=6）之間，相對峰面積的RSD在1.14%～1.65%（n=6）之間，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以12 號峰（羥基紅花黃色素A）為參照峰，測得其余21 個共有峰相對保留時間的RSD在0.86%～1.15%（n=7）之間，相對峰面積的RSD在1.22%～1.97%（n=7）之間，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（編號為S8），平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以12 號峰（羥基紅花黃色素A）為參照峰，測得其余21 個共有峰相對保留時間的RSD在1.06%～1.59%（n=6）之間，相對峰面積的RSD在1.52%～2.13%（n=6）之間，表明方法重復性良好。

2.3.2 指紋圖譜建立與相似度評價

取樣品（編號為S1-S10），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A 版分析采集的指紋圖譜，設樣品（編號為S8）的圖譜為參考圖譜，采用多點校正全譜匹配，確立22 個共有峰。結果10 批供試品溶液相對于共有模式的相似度分別為0.993，0.994，0.996，0.978，0.989，0.991，0.996，0.998，0.995，0.990，均大于0.97。指紋圖譜見圖1。

圖1 10批活血消痛酊HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of Huoxue Xiaotong Tincture

2.3.3 指紋圖譜中共有峰指認及相對峰面積計算

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A 版處理，10批樣品的指紋圖譜中共檢測到22個共有峰。與混合對照品比對，指認出8 個成分，分別為阿魏酸（3 號峰）、芍藥苷（9 號峰）、羥基紅花黃色素A（12 號峰）、丹酚酸B（14 號峰）、丹參酮ⅡA（15 號峰）、山柰素（17 號峰）、歐前胡素（19號峰）、異歐前胡素（20號峰），保留時間（tR）分別為10.207，25.859，33.818，37.502，41.639，45.221，50.054，52.119 min。其中，12號峰峰位居中，且峰面積占共有指紋峰總峰面積的35%以上，故以12 號峰（羥基紅花黃色素A）作為參照峰。

2.4 多指標成分定量分析

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果各待測成分與相鄰峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.96～1.09 之間，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

3.阿魏酸 8.芍藥苷 12.羥基紅花黃色素A 14.丹酚酸B 15.丹參酮ⅡA 17.山柰素 19.歐前胡素 20.異歐前胡素A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液（a-e：分別缺當歸和川芎、白芷、白芍、紅花、丹參）圖2 高效液相色譜圖3.Ferulicacid 8.Paeoniflorin 12.HydroxysaffloweryellowA 14.SalvianolicacidB 15.TanshinoneⅡA 17.Kaempferol 19.Imperatorin 20.IsoimperatorinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution（a-e：lacking Angelicae Sinensis Radix and Chuanxiong Rhizoma，Angel?icae Dahuricae Radix，Paeoniae Radix Alba，Croci Stigma，and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察與定量限確定：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，3.0，4.0 mL，置同一50 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。以質量濃度為橫坐標（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。以信噪比（S/N）為10∶1 時的進樣量為定量限，結果見表1。

表1 線性關系考察與定量限確定結果Tab.1 Results of the linear relation test and LOQ

精密度試驗：精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1 項色譜條件下連續進樣測定6 次，記錄色譜圖。結果阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.78%，0.65%，0.47%，1.01%，0.83%，0.71%，0.81%，0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（編號為S8），依法制備供試品溶液，分別于0，5，10，15，20，25，30，36 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.99%，0.91%，0.87%，0.81%，1.02%，1.08%，0.93%，1.13%（n= 8），表明供試品溶液36 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（編號為S8），按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素的平均 含量 分別 為0.721 2，0.419 7，0.511 8，0.421 1，1.298 0，0.181 9，0.215 0，0.218 0 mg/mL，RSD分別為0.99%，0.86%，1.02%，1.01%，0.85%，0.77%，0.92%，0.75%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批樣品（編號為S8），5 mL，共9 份，分為3 組，各3 份，按供試品中阿魏酸、芍藥苷、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A、山柰素、歐前胡素、異歐前胡素含量的80%，100%，120%精密加入相應對照品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表2。

表2 活血消痛酊中8種成分的加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of eight components in Huoxue Xiaotong Tincture（n=9）

2.4.2 樣品含量測定

取樣品（編號為S1-S10），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各成分含量。結果見表3。

表3 10批活血消痛酊8種成分含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.3 Results of the content determination of eight components in ten batches of Huoxue Xiaotong Tincture（mg/mL，n=3）

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 聚類分析［5］

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析，以10 批樣品8 種成分含量測定結果為變量，采用系統聚類分析法進行模式識別分析。類間距離為5 時10 批樣品聚成了3 類，分別為編號S3，S1，S2 聚為Ⅰ類，編號S6，S5，S4 聚為Ⅱ類，編號S9，S8，S7，S10聚為Ⅲ類。詳見圖3。

圖3 10批活血消痛酊聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of ten batches of Huoxue Xiaotong Tincture

2.5.2 正交偏最小二乘判別分析（OPLS - DA）

將10批樣品的22個共有峰數據導入SIMCA-P 14.1軟件進一步作OPLS-DA［6-7］，獲得OPLS-DA 得分圖（圖4）及重要性投影（VIP）圖（圖5）。結果，10 批樣品可分為3 個區域，分類情況與2.5.1 項下聚類分析結果一致。通過OPLS - DA 的VIP 篩選出對活血消痛酊分類結果具有統計學意義的成分，即差異性質量標志物。由圖5可知，3號峰（阿魏酸）、2號峰、7號峰、12號峰（羥基紅花黃色素A）和13號峰的VIP 均大于1，表明上述5個峰可能是區分不同批次樣品的差異性質量標志物。

圖4 10批活血消痛酊的OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores of ten batches of Huoxue Xiaotong Tincture

圖5 活血消痛酊的共有峰VIP圖Fig.5 VIP values of the common peaks Huoxue Xiaotong Tincture

3 討論

3.1 指標成分選擇

活血消痛酊組方中，丹參、當歸、川芎、紅花、白芍、白芷為主藥，君藥丹參用量占總處方量的28.8%，具有消散瘀血、疏通血脈作用，常配伍川芎、當歸以提高療效，其中丹參以活血為主，川芎偏于補氣，當歸善于補血［8-10］。紅花含有查耳酮苷類（羥基紅花黃色素A）、黃酮類（山柰素）、有機酸等多種化合物，具有增加血流量、擴張血管、改善微循環等多種藥理作用［11-12］。白芍養血止痛，助君藥活血祛瘀［13］，主要藥效成分為芍藥苷。佐藥白芷辛散溫通，利于血氣運行，主要含有歐前胡素、異歐前胡素等香豆素類成分［14-15］。2020年版《中國藥典（一部）》中，紅花、當歸、川芎、丹參、白芍、白芷的含量測定成分分別為羥基紅花黃色素A、山柰素、阿魏酸、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、芍藥苷、歐前胡素、異歐前胡素［16］。故選擇上述8種成分作為活血消痛酊的指標成分。

3.2 樣品提取方法選擇

分別考察了提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、提取溶劑（65%甲醇、45%甲醇）及超聲提取時間（35，45，55 min）和功率（300，400，500 W）對樣品各待測成分含量的影響。結果發現，采用65%甲醇超聲提取（功率為400 W）45 min，各待測成分含量較高且基線分離。

3.3 指紋圖譜

結果分析顯示，10批樣品的相似度均大于0.97，表明該制劑化學成分一致性較高。HPLC 法含量測定結果表明，8 種成分的含量存在一定差異，生產年份為2019年的樣品中8種成分的含量普遍低，可能與部分樣品已過有效期有關；生產年份為2020 年的樣品中阿魏酸含量偏低。阿魏酸屬弱有機酸，存在順式和反式2 種異構體，化學穩定性較差。建議加強此批次當歸、川芎原藥材的保存和投料管理。通過聚類和OPLS-DA化學計量方法分析共有峰峰面積發現，10 批樣品按生產年份分別聚為1 類，可能與醫院制劑生產時間較長相關；另篩選5個差異性成分，指認出阿魏酸和羥基紅花黃色素A 2個成分。建議醫院應重點關注當歸、川芎及紅花3種原藥材的相關性指標，嚴格控制提取工藝。

3.4 方法評價

本研究中建立的活血消痛酊指紋圖譜及含量測定方法簡便、準確、穩定，并結合化學計量學彌補了現有質量標準的不足，可為活血消痛酊的質量控制提供可靠依據。