烏梅丸通過Notch 信號通路治療寒熱錯雜證潰瘍性結(jié)腸炎臨床研究*

杜亞平，魏 嫦，黃 粟，韋冬玨，李玉梅，方妹輝，司會強，鄧麗娟

（廣東省珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 珠海 519000）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）為慢性炎性浸潤性腸病，可造成直腸和乙狀結(jié)腸黏膜彌漫性炎性損傷，且病情反復(fù)，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1］。中醫(yī)藥具有不良反應(yīng)少、復(fù)發(fā)率低等特點，在UC 的治療中具有獨特優(yōu)勢，多種中藥湯劑內(nèi)服及外治法在改善UC 癥狀、抑制腸黏膜炎癥等方面發(fā)揮著重要作用［2］。研究認為，UC 是由感染、遺傳、免疫異常、環(huán)境等多種因素共同作用引起的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能受損，進而誘發(fā)腸黏膜免疫炎性反應(yīng)［3］。Notch 信號通路在腸上皮細胞分化和上皮再生進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，活化的Notch 通路能破壞腸上皮黏膜屏障的防御功能，是導致UC 病情加重的重要機制［4］。烏梅丸具有寒溫并用、清補兼施的特點，治療消化系統(tǒng)疾病的療效良好［5］。既往動物實驗結(jié)果顯示，烏梅丸可通過抑制Notch 信號通路相關(guān)靶基因的表達來減輕UC 模型大鼠的腸黏膜損傷程度［6-7］。本研究中探討了烏梅丸通過Notch 信號通路治療寒熱錯雜證UC 的臨床療效，以Notch 信號通路為切入點，從細胞分子水平進一步明確烏梅丸在UC 治療中的分子機理。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012 年·廣州）》中UC 的診斷標準［8］，反復(fù)、持續(xù)發(fā)作6 周及以上的腹痛、里急后重及膿血便，伴不同程度的全身表現(xiàn)；結(jié)腸鏡下表現(xiàn)為腸黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍、接觸性出血等；UC 活動期，病灶可見糜爛、潰瘍、肉芽組織形成，慢性炎性細胞積聚、浸潤，出現(xiàn)隱窩炎或隱窩膿腫；符合《潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017 年）》中寒熱錯雜證UC 的辨證標準［9］；年齡18～65 歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（倫理審查受理號為20201215024），所有患者簽署知情同意書。

排除標準：合并腸息肉、腸穿孔、腸梗阻等并發(fā)癥及肛門疾病；急性感染性腸炎、腸易激綜合征；合并嚴重肝、腎、造血系統(tǒng)等疾病；凝血功能障礙；1 個月內(nèi)使用過激素及免疫抑制劑。

病例選擇與分組：選取我院消化內(nèi)科2020 年10 月至2021年9月收治的寒熱錯雜證UC患者80例，按隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組，各40例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較（n=40）Tab.1 Comparison of the patients′ general data between the two groups（n=40）

1.2 方法

對照組給予美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準字H19980148，規(guī)格為每片0.25 g）口服，每次1片，每日4次。觀察組給予烏梅丸口服，組方：烏梅15 g，細辛5 g，花椒10 g，制附子10 g，桂枝10 g，干姜15 g，人參10 g，當歸10 g，黃連6 g，黃柏10 g，炙甘草6 g，每日1 劑，經(jīng)常規(guī)水煎煮2 次，分早、晚2次空腹溫服。兩組患者均治療8周。

1.3 觀察指標與療效判定標準

觀察指標：1）采用改良梅奧（Mayo）量表［10］評估UC活動度，包括排便次數(shù)、便血情況、內(nèi)鏡表現(xiàn)、醫(yī)師評價4 項，分別計0 分（正常）、1 分（輕度）、2 分（中度）、3 分（重度）。2）采用Baron 量表［11］評估腸黏膜病變情況，依據(jù)黏膜病灶的內(nèi)鏡表現(xiàn)進行等級評定。黏膜無異常病變，為0 級；黏膜僅見輕度炎癥表現(xiàn)，為Ⅰ級；黏膜輕度糜爛、潰瘍，接觸性出血，為Ⅱ級；黏膜潰瘍、糜爛數(shù)量超過3個，為Ⅲ級；黏膜潰瘍、糜爛廣泛分布，為Ⅳ級。根據(jù)不同等級再計為0～4 分。3）采集患者治療前后的外周血，離心，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血清中細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）的水平，以及腸黏膜屏障功能指標二胺氧化酶（DAO）、D- 乳酸的含量。4）內(nèi)鏡下取患者治療前后腸上皮組織，提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT - PCR）試劑盒步驟檢測腸道組織Notch 信號通路相關(guān)mRNA Notch-1，Hes-1，Math-1的表達水平。5）記錄治療過程中不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括惡心嘔吐、頭暈頭痛、胃脹氣等。

療效判定［12］：治愈，臨床癥狀完全消失，內(nèi)鏡復(fù)查見腸黏膜炎癥、潰瘍和糜爛愈合；顯效，臨床癥狀基本緩解，內(nèi)鏡復(fù)查僅見腸黏膜輕度炎性反應(yīng)，潰瘍和糜爛愈合60%及以上；有效，臨床癥狀較治療前有一定程度緩解，內(nèi)鏡復(fù)查可見腸黏膜潰瘍、糜爛愈合30%～59%；無效，臨床癥狀和內(nèi)鏡復(fù)查表現(xiàn)較治療前均無明顯改善或較前加重。總有效=治愈+顯效+有效。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以±s表示，組內(nèi)比較行配對樣本t檢驗，組間比較行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表2至表7。

表2 兩組患者臨床療效比較［例（%），n=40］Tab.2 Comparison of clinical efficacy between the two groups［case（%），n=40］

表3 兩組患者治療前后Mayo、Baron量表評分比較（±s，分，n=40）Tab.3 Comparison of Mayo and Baron scores between the two groups before and after treatment（±s，point，n=40）

表3 兩組患者治療前后Mayo、Baron量表評分比較（±s，分，n=40）Tab.3 Comparison of Mayo and Baron scores between the two groups before and after treatment（±s，point，n=40）

組別t值Mayo量表評分治療前8.07 ±1.20 8.11±1.05 0.158 7 0.874 3 P值t值P值觀察組對照組t值P值治療后2.87±0.73 4.09±1.13 5.735 5 0.000 0 23.414 3 16.482 5 0.000 0 0.000 0 Baron量表評分治療前2.92±0.64 2.95±0.72 0.197 0 0.844 4治療后0.81±0.37 1.78±0.54 9.371 9 0.000 0 18.051 7 8.221 9 0.000 0 0.000 0

表4 兩組患者治療前后血清細胞因子水平比較（±s，ng/L，n=40）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels between the two groups before and after treatment（±s，ng/L，n=40）

表4 兩組患者治療前后血清細胞因子水平比較（±s，ng/L，n=40）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels between the two groups before and after treatment（±s，ng/L，n=40）

組別t值P值t值P值觀察組對照組t值P值TGF-β1治療前58.07±7.29 60.13±9.06 1.120 4 0.266 0治療后93.52±12.32 77.09±10.64 6.383 4 0.000 0 15.662 0 7.675 6 0.000 0 0.000 0 IGF-1治療前104.41±16.12 98.25±20.23 1.506 1 0.136 1治療后183.70±19.62 147.09±12.56 9.939 2 0.000 0 19.748 6 12.972 1 0.000 0 0.000 0

表5 兩組患者治療前后D-乳酸、DAO含量比較（±s，n=40）Tab.5 Comparison of D - lactic acid and DAO content between the two groups before and after treatment（±s，n=40）

表5 兩組患者治療前后D-乳酸、DAO含量比較（±s，n=40）Tab.5 Comparison of D - lactic acid and DAO content between the two groups before and after treatment（±s，n=40）

組別D-乳酸（mmol/L）治療前6.09±1.17 6.03±1.26 0.220 7 0.825 9 t值P值t值P值觀察組對照組t值P值治療后4.01±0.65 5.10±0.72 7.107 0 0.000 0 9.828 7 4.053 1 0.000 0 0.000 1 DAO（U/L）治療前7.34±1.40 7.80±1.35 1.495 9 0.138 7治療后5.04±1.15 6.29±1.22 4.715 4 0.000 0 8.028 9 5.248 5 0.000 0 0.000 0

表6 兩組患者治療前后Notch信號通路mRNA表達水平比較（±s，n=40）Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of Notch signaling pathway between the two groups before and after treatment（±s，n=40）

表6 兩組患者治療前后Notch信號通路mRNA表達水平比較（±s，n=40）Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of Notch signaling pathway between the two groups before and after treatment（±s，n=40）

組別t值P值t值P值t值P值觀察組對照組t值P值Notch-1 mRNA治療前0.87±0.13 0.92±0.10 1.928 1 0.057 5治療后0.51±0.08 0.66±0.08 8.385 3 0.000 1 14.916 1 12.840 5 0.000 0 0.000 0 Hes-1 mRNA治療前3.15±0.16 3.23±0.20 1.975 5 0.051 8治療后1.34±0.06 2.19±0.12 40.069 4 0.000 0 66.991 1 28.201 0 0.000 0 0.000 0 Math-1 mRNA治療前0.42±0.05 0.44±0.07 1.470 4 0.145 5治療后2.73±0.09 1.57±0.11 51.619 3 0.000 0 141.902 2 54.813 1 0.000 0 0.000 0

3 討論

UC 以直腸和乙狀結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍和彌漫性炎癥等病理表現(xiàn)及慢性腹瀉、黏液血便等消化道癥狀為主要特征，可伴不同程度的消瘦、貧血、乏力等全身表現(xiàn)，臨床發(fā)病率較高，且病情遷延難愈［13］。近年來，中藥煎劑內(nèi)服、中藥保留灌腸、針灸等多種中醫(yī)療法作為UC的輔助治療已在臨床廣泛應(yīng)用［14-15］。

UC 中醫(yī)歸屬“痢疾”“泄瀉”“腸癖”等范疇，病位在大腸，發(fā)病與肝、脾密切相關(guān)，病機屬虛實夾雜，以脾胃虛弱為本，濕毒內(nèi)蘊為標，治療當以寒溫并用、清補兼施為原則。烏梅丸為治療久瀉、久痢的常用方，臨床用于UC 療效確切［16］。方中，烏梅養(yǎng)陰生津、澀腸止瀉，為君藥；細辛、花椒通陽扶正、祛寒止痛，共為臣藥；附子、桂枝、干姜溫陽散寒、緩肝調(diào)脾，人參、當歸養(yǎng)肝活血、補益脾氣，黃連、黃柏清肝泄熱、燥濕止痢，共為佐藥；甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥，為使藥。全方清上溫下，土木兩調(diào)，故可用于治療上熱下寒、寒熱錯雜之證。現(xiàn)代藥理學研究表明，烏梅丸可通過抗炎、解痙、止瀉、促進黏膜修復(fù)等多種途徑發(fā)揮對UC 的治療作用［17-18］。本研究結(jié)果顯示，觀察組的總有效率顯著高于對照組，治療后的Mayo量表和Baron量表評分均顯著低于對照組，表明烏梅丸治療UC的療效較美沙拉嗪更顯著。

TGF - β1為TGF - β 超基因家族成員中占比最高的一類細胞因子，與UC 炎性反應(yīng)密切相關(guān)［19］。IGF-1是由肝細胞合成并分泌的一類具有代謝效應(yīng)和炎性調(diào)節(jié)功能的細胞因子，在UC 的生理病理進程中發(fā)揮重要作用［20］。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者治療后的血清TGF - β1和IGF - 1 水平均顯著升高，表明烏梅丸能有效減輕炎性反應(yīng)，從而減輕黏膜損傷。血清D-乳酸和DAO 分別為腸道菌群代謝產(chǎn)物和腸黏膜中的細胞內(nèi)酶，UC 發(fā)生后引起腸黏膜通透性增加，使D- 乳酸和DAO 進入血液循環(huán)，加重病情［21-22］。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者治療后的血清D-乳酸和DAO 的含量均顯著降低，表明烏梅丸可通過提高腸黏膜功能，穩(wěn)定腸黏膜屏障而發(fā)揮治療作用。

Notch 信號通路的活化在腸道上皮再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能調(diào)節(jié)腸上皮細胞分化，并參與腸黏膜的修復(fù)過程［23］。Notch 過度活化時其靶基因Hes - 1 的表達可誘導腸上皮細胞向吸收細胞轉(zhuǎn)化，Hes- 1 的表達又可抑制Math-1促使上皮細胞向分泌細胞轉(zhuǎn)化的功能，進而減少杯狀細胞等分泌細胞的數(shù)量，損害腸上皮黏膜屏障的防御功能，誘發(fā)炎性反應(yīng)［24］。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者治療后的Notch - 1 和Hes - 1 mRNA 表達水平均顯著降低，Math - 1 mRNA 的表達水平顯著升高，表明烏梅丸對UC 患者Notch 信號通路的過度激活具有一定調(diào)節(jié)作用，能抑制Notch-1，Hes-1 mRNA 的表達，促進Math- 1 mRNA 的表達和腸上皮的再生，修復(fù)腸黏膜屏障的防御功能，減輕黏膜損傷，發(fā)揮對UC的治療作用。本研究中觀察組患者不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于對照組，表明安全性良好。

綜上所述，烏梅丸治療寒熱錯雜證UC 的臨床療效優(yōu)于常規(guī)西藥治療，可有效促進患者的腸黏膜愈合，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Notch 信號通路，促進腸黏膜屏障修復(fù)和減輕炎性反應(yīng)相關(guān)。