燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的有效成分及作用機制網絡藥理學分析*

丁 夢，何帥兵，謝學恒，王 振，辜升亮，胡振波，黃 斌，邢小燕△，孫曉波

（1.中國醫學科學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193； 2.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025； 3.浙江省湖州師范學院醫學院，浙江 湖州 313000； 4.浙江省湖州師范學院護理學院，浙江 湖州 313000； 5.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650106）

認知功能障礙是指因學習記憶、思維判斷出現異常而引起嚴重學習記憶障礙，同時可能會伴隨失語、失行和失認等改變的病理過程［1］。認知功能障礙可分為神經退行性和非神經退行性兩類，可并發于多種疾病，嚴重損害患者的認知能力［2］。隨著人口老齡化程度的加劇，在缺乏有效干預措施或對神經疾病清晰理解的情況下，神經變性的發生率急劇升高［3］。有研究表明，定期身體活動和心血管危險因素（如糖尿病、肥胖、吸煙和高血壓）的管理可降低認知能力和癡呆癥的發生風險［4］。2015 年全球有4 700 萬癡呆癥患者，預計2050 年將增加2倍［5］。故有必要找到新的方法和藥物治療認知功能障礙。燈銀腦通膠囊為彝族藥，是由燈盞細辛、銀杏葉、滿山香及三七4種中藥的有效成分精制而成的復方制劑。有研究表明，燈銀腦通膠囊單用或聯用其他藥物可治療腦梗死后遺癥、急性腦梗死、循環缺血性眩暈及抑郁癥［6-9］。李特等［10］的研究表明，燈銀腦通膠囊對衰老模型小鼠有促智作用，能增強小鼠的學習能力及記憶保持能力。曲艷津等［11］的研究表明，燈銀腦通膠囊聯合奧拉西坦可治療血管性癡呆，明顯改善患者腦微循環和認知功能障礙，但治療后者的作用機制并未闡明。網絡藥理學以藥物- 疾病- 成分- 靶點相互作用的完整性和系統化為起點，使用復雜的網絡模型來表達和分析藥物-成分-靶點網絡關系［12］。網絡藥理學的整體特征和系統特征與中醫理論的整體觀和基于綜合征分化的治療原則相一致，為中藥的系統研究提供了新的思路和視角［13］。近年來，網絡藥理學廣泛應用于中藥活性成分和作用機制研究。為此，本研究中采用網絡藥理學分析燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的有效成分群及作用機制。

1 方法

1.1 活性成分篩選與靶點收集

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）［14］、中醫藥研究綜合數據庫（TCMID）［15］和網絡藥理學數據分析數據挖掘系統（TCM-Mesh）［16］等收集燈銀腦通膠囊的化學成分。參數設置如下：口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）分別設置為15%和0.18［14］。利用毒性與基因比較數據庫（CTD）［17］、Drug Bank［18］、STITCH［19］、BindingDB［20］、SwissTarget［21］等數據庫收集相關成分的靶點，其中STITCH，BindingDB，SwissTarget 數據庫的閾值分別設置為0.70，0.85，0.85。利用UniProt［22］數據庫實現靶點的標準化。

1.2 疾病相關靶點收集

利用DisGeNET［23］、PharmGKB［24］、CTD 數據庫檢索Cognitive Dysfunction，收集認知功能障礙相關靶點，去除重復靶點，即為認知功能障礙相關靶點。

1.3 蛋白互作（PPI）網絡構建與網絡聚類分析

為收集藥物和疾病的重疊靶點，采用Venn Diagrams在線分析工具對燈銀腦通膠囊活性成分靶點和認知功能障礙疾病靶點進行分析，并在Cytoscape 3.2.1［25］軟件中實現可視化。將維恩圖中交集靶點導入String［26］數據庫，獲取PPI 網絡信息。PPI 得分的最低閾值設置為0.4，采用Cytoscape 3.2.1 軟件實現網絡的可視化。同時，為識別燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的核心靶標網絡，采用Cytoscape 3.2.1 軟件中的MCODE cluster實現聚類分析。

1.4 KEGG 通路和GO 富集分析

為說明燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的潛在機制及影響，采用CTD 數據庫進行GO 生物學過程富集分析［27］和KEGG 信號通路富集分析［28］，校正P值閾值均設置為0.01。

1.5 關鍵靶點識別

采用Cytoscape 3.2.1 軟件中的MCC 和Stress 算法準確識別出燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的靶點，取兩者排名前10靶點的交集作為燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的關鍵靶點。

2 結果

2.1 活性成分篩選及活性成分靶點推測

本研究中從燈盞細辛、銀杏葉、三七、滿山香4種中藥中共收集化學成分133個，共涉及靶點588個。

2.2 化學成分靶點與認知功能障礙相關靶點的重合度

共收集與認知功能障礙相關的靶點303個，并對燈銀腦通膠囊化學成分靶點和認知功能障礙疾病靶點作一致性分析，乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BChE）、胱天蛋白酶3（CASP3）等87個靶點與認知功能障礙疾病靶點重合，占全部認知功能障礙相關基因的28.71%。與文獻［29-31］的研究結果一致，可能通過這87個靶點實現對認知功能障礙的綜合調控，維恩圖見圖1。

圖1 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的關鍵靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of the key targets of Dengyin Naotong Capsules in the treatment of cognitive dysfunction

2.3 PPI 與MCODE cluster 網絡聚類分析

研究發現，燈銀腦通膠囊中共有62 個成分參與認知功能障礙調控，構成了燈銀腦通治療認知功能障礙的有效成分群。其中，度值排名前10的成分分別為木犀草素、山柰酚、芹菜素、兒茶素、黃芩素、柚皮素、異鼠李素、齊墩果酸、槲皮素和五羥黃酮（表1）。度值越大，相應化學成分參與調控認知功能障礙相關基因數目越多。在Cytoscape 3.2.1 軟件中輸入燈銀腦通膠囊中的4 種中藥、62 種參與調控認知功能障礙的化學成分和87 個參與調控認知功能障礙的靶點，得到藥物- 活性成分- 靶點網絡（圖2）。采用String 數據庫構建PPI 網絡，網絡涉及節點87個、邊1 399條（圖3）。

表1 度值排名前10的活性成分Tab.1 Top 10 active ingredients of Degree value

圖2 燈銀通膠囊治療認知功能障礙的藥物-活性成分-靶點網絡Fig.2 Drug - active ingredients - targets network of Dengyin Naotong Capsules in the treatment of cognitive dysfunction

圖3 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的蛋白互作網絡Fig.3 PPI network of Dengyin Naotong Capsules in the treatment of cognitive dysfunction

以PPI 網絡為輸入，聚類分析識別出3 個模塊。模塊A為燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的主要模塊，由42 個靶點組成，涉及716 條邊；模塊B 由9 個靶點組成，涉及19 條邊；模塊C 由3 個靶點組成，涉及3 條邊。詳見圖4。

A.模塊A B.模塊B C.模塊C圖4 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的MCODE cluster分析A.Module A B.Module B C.Module CFig.4 MCODE cluster analysis of Dengyin Naotong Capsules in the treatment of cognitive dysfunction

2.4 KEGG 通路與GO 富集分析

對圖4 中3 個模塊網絡進行KEGG 通路富集分析，發現25條信號通路與燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙相關，如腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素17（IL - 17）信號通路、細胞凋亡和Toll 樣受體信號通路等。詳見表2。

表2 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的25條信號通路Tab.2 The 25 signal pathways of Dengyin Naotong Capsules in the treatment of cognitive dysfunction

將KEGG 通路富集分析識別的25 條信號通路進行GO 生物學過程富集分析，結果共涉及1 191 條生物過程。P值排序前25 的生物過程認為和燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙密切相關，主要集中于細胞對內/外源性化學物質刺激的反應、對外界物理刺激的反應、細胞凋亡過程和代謝過程的正向調控等（圖5）。

圖5 GO生物學過程富集分析前25位結果Fig.5 Top 25 results of the GO biological process enrichment analysis

2.5 識別關鍵靶點

分別得到MCC和Stress 2種算法排名前10的靶點。兩者交集有9個靶點，認為在燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙發揮重要作用，分別為血管內皮生長因子A（VEGFA）、CASP3、胰島素（INS）、白細胞介素6（IL-6）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、TNF、白蛋白（ALB）和腫瘤蛋白P53（TP53）。詳見圖6。

A.MCC算法 B.Stress算法圖6 MCC和Stress算法排名前10靶點A.MCC algorithm B.Stress algorithmFig.6 MCC and Stress algorithms rank in the top 10 targets

3 討論

3.1 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的活性成分

本研究通過TCMSP，TCMID，TCM-Mesh 等數據庫共獲得62個燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的活性成分。其中，度值排名前10 的成分分別為木犀草素、山柰酚、芹菜素、兒茶素、黃芩素、柚皮素、異鼠李素、齊墩果酸、槲皮素和五羥黃酮。除齊墩果酸外，其余成分均為黃酮類化合物，此類化合物多具有抗炎、抗氧化應激等藥理作用［32］。YAO 等［33］的研究發現，木犀草素改善超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性，抑制海馬和皮層中小膠質細胞過度激活和星形膠質細胞增多，改善神經炎癥和氧化應激在慢性腦灌注不足（CCH）后的認知功能障礙。DAS 等［34］和KIM等［35］的研究發現，山柰酚和芹菜素都可通過促進肌球蛋白受體激酶B（TrkB）的表達來改善認知功能障礙。PERVIN等［36］的研究發現，兒茶素對有神經退行性損傷引起的認知功能障礙和記憶喪失有益。此外還發現，黃芹素和柚皮素具有神經保護作用。LI等［37］研究發現，黃芩素通過直接作用于大腦而非通過調節血糖、脂質或INS的水平來改善糖尿病模型大鼠的認知功能；KRISHNA等［38］研究發現，柚皮素可通過維持線粒體功能并防止由甲基汞誘導的小鼠神經細胞凋亡，最終改善模型小鼠認知障礙。MULATI 等［39］研究發現，異鼠李素通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉錄因子- κB（NF-κB）通路緩解由高脂高糖飲食誘導的認知功能障礙和神經炎癥，還發現槲皮素可通過改善神經炎癥來改善衰老模型小鼠的認知功能障礙。此外，槲皮素可降低小鼠海馬體中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的水平［40］。故推測燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的重要活性成分是黃酮類化合物，通過抗炎和抗氧化應激來發揮其功效。

3.2 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的關鍵靶點

共收集燈銀腦通膠囊成分靶點與認知功能障礙疾病靶點有87 個交集靶點，這些靶點被認為是燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的潛在靶點。為了探索其核心靶點，構建了PPI網絡，并進行了網絡聚類分析，取MCC和Stress 2 種算法排名前10 的交集作為燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的核心靶點。結果顯示，核心靶點包括VEGFA，CASP3，INS，IL - 6，AKT1，PTGS2，TNF，ALB，TP53 9個靶點。MOORE等［41］研究發現，VEGFA 在阿爾茨海默病（AD）風險最高的人群中具有保護作用。KIM 等［35］研究發現，芹菜素可通過抑制CASP3的裂解，促進細胞凋亡，從而改善認知功能障礙。吳勇等［42］研究發現，微量INS可增加認知功能障礙模型大鼠海馬組織中突觸蛋白的表達，改善認知功能障礙。IL - 6 在細胞免疫和體液免疫中發揮重要作用，TNF-α 在炎性反應調節過程中起核心作用，認知功能障礙患者中樞神經系統中IL-6 與TNF-α 表達水平顯著升高［43］。大腦突觸的破壞被認為是AD 患者認知功能障礙的根源，ROS介導AKT1 信號傳導失調加重了AD 患者突觸功能障礙［44］。增強AKT1 激酶的活性可保護突觸免受破壞，對突觸的可塑性、學習、記憶具有深遠的影響。PTGS2在腦手術后可促進TNF - α 和IL - 1β 等炎性因子的表達，導致神經炎癥發生，從而出現術后認知功能障礙［45］。此外，在輕度認知功能障礙和AD 患者的外周細胞中觀察到P53 構象折疊錯誤的現象，P53 失調可能加劇AD 的病理機制［46］。由此，可看出上述靶點與認知功能障礙的發生、發展密切相關。

3.3 燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的途徑

為探討燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的作用機制，進行了KEGG 通路富集分析和GO 生物學過程富集分析。KEGG 通路富集分析結果顯示，燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙中涉及，TNF、IL-17、凋亡和Toll 樣受體等25 條信號通路。AKT1，CASP3，IL- 6，PTGS2，TNF等靶點是TNF 信號通路的關鍵成員，且篩選出的多種活性成分均可調控這些靶點，表明TNF 信號通路在燈銀腦通膠囊調控認知功能能障礙中發揮著重要作用。木犀草素是燈銀腦通膠囊的重要活性成分，可抑制TNF - α，IL - 6，IL - 1β 等炎性因子的表達，從而抑制神經炎癥的發生，緩解AD 引起的認知障礙［47］。有關動物實驗表明，其活性成分槲皮素和山柰酚可下調TNF-α，IL-17 的表達［48］。維持海馬神經元正常狀態對于認知功能是十分重要，海馬神經細胞凋亡與炎癥是導致術后認知功能障礙的主要原因［49］。SU 等［50］研究發現，托吡酯通過滅活術后認知功能障礙模型大鼠中的TNF 信號通路來發揮抗炎和抗細胞凋亡作用。秦建華等［51］的研究發現，低劑量七氟醚通過調節PI3K/ AKT 信號通路抑制海馬神經細胞凋亡，從而改善術后認知功能障礙。Toll 樣受體（TLRs）能結合機體自身產生的一些內源性分子，在先天免疫和無菌炎癥中起核心作用，LIN 等［52］的研究發現，Toll 樣受體2 有助于減輕手術誘導的神經炎癥和認知障礙。YE 等［53］的研究發現，通過阻斷IL - 17A / IL - 17R 通路抑制小膠質細胞的激活和神經炎癥，從而保護小鼠免受由膿毒癥誘發的認知功能障礙。

3.4 本研究不足之處

燈銀腦通膠囊的活性成分木犀草素、山柰酚、芹菜素、兒茶素、黃芩素、柚皮素、異鼠李素、齊墩果酸、槲皮素 和 五 羥 黃 酮 可 作 于VEGFA，CASP3，INS，IL-6，AKT1，PTGS2，TNF，ALB，TP53 等多個靶點，調節TNF、IL - 17、凋亡和Toll 樣受體等多種信號通路，抑制炎性反應和氧化應激，從而治療認知功能障礙。本研究基于現代生物信息學方法，通過網絡藥理學方法探討燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的作用機制，具有一定局限性，對燈銀腦通膠囊治療認知功能障礙的有效成分群及作用機制僅進行初步預測，并未進行試驗驗證。