電沉積法制備絲素蛋白基水凝膠及其釋藥性能研究

方昊 羅玨君 李夢妍 李佩珊 張小寧

摘要： 為開發一種無毒無污染且緩釋時間長的絲素蛋白（SF）基藥物緩釋載體，本文采用電沉積法在低電壓下制備SF基水凝膠，分析了不同制備電壓、溶液中不同SF質量比下制得水凝膠的宏觀形貌、微觀形貌、力學性能、細胞毒性、降解性能和藥物緩釋性能。結果表明：制備的SF基水凝膠呈乳白色，表面光滑，具有豐富致密的網絡結構，抗壓縮性能可隨制備參數實現可控調節，不具備細胞毒性。在模擬胃液、模擬傷口滲出液和模擬體液中，SF基水凝膠的穩定性隨著制備電壓的增加而增強。以鹽酸小檗堿為模型藥物，研究發現制備得到的SF基水凝膠的釋藥規律符合一級動力學方程。

關鍵詞： 絲素蛋白;水凝膠;電沉積法;藥物載體;釋放動力學

中圖分類號： TS101.4; TQ340.64

文獻標志碼： A

文章編號： 1001-7003（2023）07-0001

作者簡介：

方昊（2001），男，2019級生物技術專業本科生，研究方向為絲素蛋白基水凝膠的制備及應用。通信作者：張小寧，副教授，xzhang@swu.edu.cn。

自20世紀90年代以來，藥物緩釋體系一直是藥物劑型和制劑研究中的熱點。相較傳統給藥方式，藥物緩釋體系有利于延長藥物作用時間、減輕患者多次用藥痛苦、提高藥物利用度、降低毒副作用［1］，從而增強臨床用藥的有效性和安全性。藥物緩釋載體是藥物緩釋體系的重要組成部分［2］，因此，開發藥物緩釋載體對提高臨床用藥水平具有重要意義。

近年來，多孔聚合物水凝膠用作藥物緩釋載體的研究備受關注［3-5］。水凝膠具有天然的三維網絡狀結構及良好的物理機械性能［6］，能夠有效載荷藥物，保護藥物不被降解，控制藥物持續和緩慢釋放［5］。絲素蛋白（Silk Fibroin，SF）作為蠶絲的主要組成蛋白，占蠶絲總質量的70%～80%［7］，具有來源豐富、價格低廉、生物相容性良好、免疫原性低、可塑性強、降解性可控、無毒、無污染等特點，被視為制備水凝膠藥物緩釋載體的最佳原材料之一［8］。然而，載藥SF基水凝膠存在藥物初期突釋問題，即SF基水凝膠在裝載藥物后會出現早期藥物高濃度釋放現象，不利于達到長期有效的藥物緩釋效果。研究表明，通過改進制備工藝、縮短凝膠化時間可以緩解突釋現象［9］。

目前，促進再生SF溶液凝膠化的方法有很多［10］。相比常見的有機溶劑誘導法［11-12］和酶促交聯法［13-14］，電沉積法用于制備SF基水凝膠具有時間短、綠色環保、經濟簡便的優點［15］。電沉積法是指在電場作用下，陽極附近的水電解產生大量氫離子，促使帶負電荷的SF分子聚集，與氫離子發生中和反應后沉積形成水凝膠的方法［16］。如Leisk等［17］將兩個鉛質電極置入SF溶液中，施加25 V直流電壓3 min后，便可在陽極上制得SF水凝膠，但在25 V電壓下電極表面會析出大量氣泡，導致制備的SF水凝膠形狀不均勻。Liu等［18］在3 V電壓下制備了SF水凝膠，但制備時間長達6 h，當電壓增加到6 V時仍需1 h成膠，成膠時間過長。本文前期研究發現，在再生SF溶液中加入羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan，CMCS）可降低SF成膠電壓和成膠時間，從而提高成膠效率［16］。CMCS是殼聚糖衍生物之一，來源廣泛，因其具有無毒，抗菌，生物相容性、水溶性和可降解性良好等優點，制備得到的SF基水凝膠（SF/CMCS水凝膠）在藥物緩釋領域具有廣闊的應用前景［19］。

小檗堿（Berberine，BBR）又稱黃連素，具有抗炎、抗菌等藥理作用，有助于促進胃炎的治療和傷口的愈合［20-21］。由于口服BBR吸收效果較差、肌注BBR無法長時間維持血藥濃度，使用有效的藥物緩釋載體以提高BBR的療效顯得至關重要［22］。本文擬通過改變電沉積參數可控調節SF/CMCS水凝膠的交聯程度，進而制備出具備不同緩釋性能的SF/CMCS水凝膠，并以BBR為藥物模型，評價各制備參數下制備得到的SF/CMCS水凝膠在不同應用場景下用作藥物緩釋載體的可行性。

1 試 驗

1.1 材料與儀器

材料：蠶繭（四川省閬中蠶種場），羧甲基殼聚糖相對分子質量543.519 g/mol、取代度≥95%（上海瑞永生物科技有限公司），氯化鈉（上海晶純生化科技股份有限公司），粉劑PBS磷酸鹽緩沖液（重慶潤晨生物技術有限公司），無水氯化鈣（成都市科隆化學品有限公司），無水乙醇、無水碳酸鈉、鹽酸（重慶川東化工有限公司），粉劑SBF模擬體液（重慶阿米達生物科技有限公司），鹽酸小檗堿水合物（上海邁瑞爾化學技術有限公司），高糖培養基（DMEM）（美國HyClone公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），苯酚（阿拉丁科技（中國）有限公司），二甲基亞砜（DMSO）和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（德國Biofroxx公司）。

儀器：HZK-FA210型電子天平（福建華志電子科技有限公司），FL-2型封閉式可調節電爐（北京市永光明醫療儀器有限公司），SYG-1220型水浴鍋（美國精騏有限公司），Milli-Q型純水儀（Millipore中國有限公司），CHI760E型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司），PHS-3E型pH值計（上海儀電科學科學儀器股份有限公司），GTM-2100型微機控制電子萬能材料試驗機（上海協強儀器制造有限公司），LGJ-10型真空冷凍干燥機（上海豫明儀器有限公司），D3400型數碼相機（日本尼康株式會社），TM4000Plus型掃描電子顯微鏡（日本株式會社日立制作所），SBC-12型離子濺射儀（北京中科科儀股份有限公司），MH-Ⅰ型微量振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司），SynergyH1型多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），HQH-250型智能人工氣候箱（上海躍進醫療器械有限公司），LYGZ-2102C型光照恒溫搖床（常州金壇良友儀器有限公司），759S型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），XDS-ⅠB型倒置生物顯微鏡（重慶重光實業有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 絲素蛋白/羧甲基殼聚糖水凝膠的制備

稱取蠶繭，剪碎后，以1︰50的浴比加入0.5% Na2CO3溶液中煮沸30 min，撈出蠶繭并用去離子水反復搓洗直至無滑膩感。重復上述操作2次，在室溫條件下晾干后獲得絲素蛋白纖維。將絲素蛋白纖維以1︰10的浴比加入三元溶劑中，置于70 ℃的水浴鍋內，玻璃棒不斷攪拌，直至絲素蛋白完全溶解。將上述制備的溶液冷卻后透析3 d，透析完之后進行過濾及離心。測定絲素蛋白溶液的質量分數，并將其調節至10%。

將質量分數為10%的絲素蛋白溶液分別與質量分數為4%和2%的CMCS溶液混合，使用電化學工作站的計時電流法（chronoamperometry）調控制備電壓［16］，分別獲得4種不同的SF/CMCS水凝膠：制備電壓為3 V，SF與CMCS質量比為5︰1的SF/CMCS水凝膠（記為SC-3V-5︰1）;制備電壓為3 V，SF與CMCS質量比為5︰2的SF/CMCS水凝膠（記為SC-3V-5︰2）;制備電壓為4 V，SF與CMCS質量比為5︰1的SF/CMCS水凝膠（記為SC-4V-5︰1）;制備電壓為4 V，SF與CMCS質量比為5︰2的SF/CMCS水凝膠（記為SC-4V-5︰2）。

1.2.2 宏觀形貌觀察

采用D3400型數碼相機觀察并記錄多個制備得到的4種不同SF/CMCS水凝膠的宏觀形態。

1.2.3 微觀形貌觀察

將4種不同的SF/CMCS水凝膠用LGJ-10型真空冷凍干燥機冷凍干燥后進行噴金處理，并通過SEM觀察SF/CMCS水凝膠內部的微觀形貌結構。

1.2.4 抗壓縮測試

使用GTM-2100型微機控制電子萬能材料試驗機測量4種不同的SF/CMCS水凝膠的抗壓機械性能。將試驗機設定為壓縮模式，將SF/CMCS水凝膠放置于基座，以1 mm/min的位移速率測定其在壓縮測試下的最大應力，直至樣品碎裂。使用雙因素方差分析法對各組最大應力開展數據分析（*為P＜0.05，** 為P＜0.01，*** 為P＜0.001，n=3）。

1.2.5 細胞毒性測試

以人胚腎上皮細胞（HEK-293）為模型進行MTT試驗，測試4種不同的SF/CMCS水凝膠的細胞毒性。取冷凍干燥后的SF/CMCS水凝膠0.2 g置于10 mL DMEM完全培養基（含10%胎牛血清）中，使其完全沉浸，于37 ℃、5% CO2培養箱中平衡72 h。浸提完成后過濾提取液，并裝入無菌試管內，置于4 ℃冰箱保存備用。配置5 mg/mL的MTT溶液（溶劑為PBS溶液）置于-20 ℃冰箱保存備用。

試驗中分別加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，記為完全培養基組;滅菌后的64 g/L苯酚溶液（溶劑為DMEM完全培養基），記為苯酚組;4種SF/CMCS水凝膠浸提液對HEK-293細胞進行培養。將單細胞懸液以2×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2環境中培養24 h，使其貼壁生長。然后舍棄培養基，加入100 μL完全培養基，再分別加入10 μL完全培養基、SF/CMCS水凝膠浸提液及苯酚溶液，培養1、3 d和5 d后使用XDS-IB型倒置生物顯微鏡分別拍照記錄。隨后加入20 μL MTT溶液，繼續于5% CO2環境中培養4 h后，吸取培養液加入200 μL DMSO，再加3個空白DMSO溶液為對照，培養板于微量振蕩器中震蕩15 min后，使用SynergyH1型多功能酶標儀檢測490 nm處各孔吸光值。使用單因素方差分析法對吸光值展開數據分析（*為P＜0.05，** 為P＜0.01，*** 為P＜0.001，n=3）。通過各組吸光值的差異，可以反映出各組細胞密度的差異，檢測4種不同SF/CMCS水凝膠的細胞毒性。

1.2.6 降解性能測試

通過查閱文獻可知，模擬胃液的pH值為1.2［23］，溫度為37 ℃［24］;模擬傷口滲出液的pH值為6.0［25］，溫度為32 ℃［26］;模擬體液可通過購得的SBF模擬體液（粉劑）進行配置，溫度為37 ℃［25］。SF/CMCS水凝膠用濾紙吸干表面水分后用電子天平準確稱重，記為m，再于HQH-250型智能人工氣候箱中分別浸入37 ℃下的模擬胃液、32 ℃下的模擬傷口滲出液及37 ℃下的模擬體液中進行降解試驗。在指定時間取出SF/CMCS水凝膠，用濾紙吸干樣品表面水分后稱重，記為mt。質量損失率（W）由下式計算得出：

W/%=m-mtm×100（1）

式中：W為質量損失率，%;m為樣品初始質量，g;mt為不同降解時間（t）對應的樣品質量，g。

1.2.7 釋藥性能及機制解析

選擇BBR作為藥物釋放研究的模型藥物，分別制備以水、模擬胃液和模擬傷口滲出液為溶劑的BBR溶液標準曲線。以水為溶劑的BBR溶液標準曲線是為了對4種SF/CMCS水凝膠的載藥量進行測定;以模擬胃液和模擬傷口滲出液為溶劑的BBR溶液標準曲線是為了在模擬胃液和模擬傷口滲出液環境下進行藥物緩釋性能測試時，對緩釋液中BBR的質量濃度進行測定，并計算出BBR的釋放量，從而得到一定時間內BBR的累計釋放量。

將4種不同的SF/CMCS水凝膠浸泡在BBR的水溶液中，抽取真空放置30 min，重復3次，隨后通過BBR溶液質量濃度的變化情況，對SF/CMCS水凝膠的載藥量進行計算。將載藥后的SF/CMCS水凝膠放入模擬胃液和模擬傷口滲出液中，置于恒溫搖床上以100 r/min的轉速進行釋放，在特定時間點吸取緩釋液并用759S型紫外可見分光光度計在BBR最大吸收波長345 nm處測定溶液的吸光度，通過標準曲線，測定緩釋液中的BBR含量，并計算累計釋放量。

分別使用零級動力學（式（2））［28］、一級動力學（式（3））［29］、Higuchi模型（式（4））［30］和Ritger-Peppas模型（式（5））［31］對藥物的釋放曲線進行擬合。通過比較各模型的擬合相關系數（R2），探討釋藥機理。

式中：t為釋放時間;Mt為t時的累計釋放量;M∞為∞時的累計釋放量;Mt/M∞為t時的累計釋放百分率;K為常數;n是Ritger-Peppas模型中表征釋放機制的特征參數。

2 結果與分析

2.1 宏觀形貌分析

通過前期試驗發現：當施加電壓小于3 V時，SF/CMCS水凝膠無法從電極片上進行剝離;當施加電壓大于5 V時，會導致SF/CMCS水凝膠表面結構粗糙，并且出現明顯可見的由析氧反應生成的氧氣泡造成的大孔;4%是CMCS水溶液保持穩定狀態的最高質量/體積比［16］。在本文中SF/CMCS水凝膠制備條件為施加電壓分別為3 V和4 V，溶液分別為10% SF和4% CMCS的混合溶液及10% SF和2% CMCS的混合溶液。

通過對4種SF/CMCS水凝膠的宏觀形貌進行觀察，發現皆呈乳白色，表面光滑，如圖1所示。

2.2 微觀形貌分析

利用SEM對4種SF/CMCS水凝膠的微觀結構進行觀察，發現均呈現三維孔狀結構，能夠裝載藥物［1］，如圖2所示。對各組SF/CMCS水凝膠的孔徑統計結果（表1），發現隨著制備電壓的升高，凝膠孔徑減小，表明SF/CMCS水凝膠的交聯度增加。這是由于隨著制備電壓的升高，陽極附近產生的氫離子增多，促進了中和反應，使得凝膠內部結構變得更加致密。此外，隨著CMCS質量分數的增加，樣品孔徑也減小，同樣表明SF/CMCS水凝膠交聯度的增加。這歸因于CMCS質量分數的增加使其與SF分子更充分交聯，使得SF/CMCS水凝膠內部結構變得更加致密。

2.3 抗壓縮性能分析

為了探究4種SF/CMCS水凝膠作為藥物緩釋載體時抵抗外力擠壓的能力，本文對4種SF/CMCS水凝膠的抗壓縮力學性能進行研究，如圖3所示。由圖3可見，隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，SF/CMCS水凝膠的最大應力也會增大。綜合微觀形貌表征結果，這是隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，水凝膠的孔徑逐漸減小，交聯度逐漸增大，水凝膠的結構變得更加致密所導致的。因此，提高制備電壓和CMCS質量分數均可增強SF/CMCS水凝膠的抗壓縮力學性能。

2.4 細胞毒性分析

為評價不同條件下制備得到的SF與CMCS交聯產物的細胞相容性，本文對4種SF/CMCS水凝膠的細胞毒性進行分析，試驗結果如圖4所示。由圖4（a）可見，除苯酚組外，SF/CMCS水凝膠浸提液組的吸光值在第一天均顯著大于完全培養基組，在第三天均與完全培養基組無顯著性差異。在第五天時，SC-3V-5︰1和SC-4V-5︰1的吸光值顯著大于完全培養基組，SC-3V-5︰2和SC-4V-5︰2的吸光值與完全培養基組無顯著性差異。苯酚組從第一天到第五天，吸光值均顯著低于完全培養基組（P＜0.001）。由圖4（b）可見，SF/CMCS水凝膠浸提液組和完全培養基組細胞均貼壁生長、正常增殖，而苯酚組細胞呈圓形、增殖停滯。綜上所述，4種SF/CMCS水凝膠均不具有細胞毒性，且SC-3V-5︰1和SC-4V-5︰1的水凝膠浸提液能夠顯著地促進細胞生長。

2.5 降解性能分析

本文對4種SF/CMCS水凝膠在模擬胃液、模擬傷口滲出液和模擬體液中的穩定性分別進行了探究，在三個環境中降解率隨時間變化的曲線如圖5所示。在模擬胃液、模擬傷口滲出液和模擬體液三個環境中，隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，SF/CMCS水凝膠的降解速率減弱。結合微觀形貌的研究結果，這歸因于隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，水凝膠的孔徑逐漸減小，交聯度逐漸增大，水凝膠的結構變得更加致密，使得水凝膠的穩定性增加。值得注意的是，在模擬傷口滲出液環境中，SC-3V-5︰1水凝膠形成更加易碎的結構。即盡管SC-3V-5︰1沒有完全降解，但在吸干凝膠表面水分稱重過程中，水凝膠極易黏在濾紙表面，進而破碎（圖5（b）），無法繼續試驗。因此，SC-3V-5︰1在傷口滲出液中的降解試驗在72 h被迫終止。在模擬體液中，4種SF/CMCS水凝膠的降解速率增快，SC-3V-5︰1在4 h時完全降解，SC-4V-5︰2在12 h也基本完全降解。這表明在模擬體液中，4種SF/CMCS水凝膠都不適用于作為長效緩釋藥物載體材料。因此，在后續試驗中，僅在模擬胃液和模擬傷口滲出液中對4種SF/CMCS水凝膠進行藥物緩釋性能的評價。

2.6 藥物緩釋性能分析

為了探究4種SF/CMCS水凝膠在模擬胃液和模擬傷口滲出液中是否具有藥物緩釋的能力，本文對4種SF/CMCS水凝膠在模擬胃液和模擬傷口滲出液中的藥物緩釋性能進行分析，如圖6所示。由圖6可見，BBR在純水、模擬胃液和模擬傷口滲出液中的三條標準曲線，擬合度均達到0.99以上。

在釋放的初始階段，各組SF/CMCS水凝膠在模擬胃液和模擬傷口滲出液兩種環境中均發生一定程度的突釋，隨著釋放時間的延長，BBR釋放速率逐漸減慢，曲線斜率接近零，表明SF/CMCS水凝膠的藥物釋放達到平衡，如圖7所示。在模擬胃液中，SC-3V-5︰1、SC-3V-5︰2、SC-4V-5︰1和SC-4V-5︰2的釋放曲線分別在12、12、48 h和60 h后趨于平衡狀態，對BBR的釋放率在96 h時分別達到41.67%、74.73%、65.01%和74.93%，如圖7（a）所示。在模擬傷口滲出液中，SC-3V-5︰1、SC-3V-5︰2、SC-4V-5︰1和SC-4V-5︰2的釋放曲線分別在48、12、60 h和48 h后趨于平衡狀態，對BBR的釋放率在96 h時分別達到51.06%、28.29%、57.65%和47.49%，如圖7（b）所示。SF/CMCS水凝膠的多孔結構有利于負載藥物，伴隨著SF/CMCS水凝膠的降解，孔狀結構被破壞進而誘導所負載藥物的釋放［32］。除SC-3V-5︰1組外，SF/CMCS水凝膠在模擬胃液中對BBR的釋放率要高于其在模擬傷口滲出液中對BBR的釋放率，這可歸因于溫度的升高對藥物釋放的促進作用［33］。相比于模擬胃液，模擬傷口滲出液使得SC-3V-5︰1組水凝膠形成更易碎裂的結構（圖5（b）），這可能是其在模擬傷口滲出液中對BBR有更高釋放率的原因。此外，在96 h時仍有部分負載BBR的SF/CMCS水凝膠未降解，因此在模擬胃液和模擬傷口滲出液中，水凝膠在96 h內藥物累計釋放率均無法達到100%。

為了研究SF/CMCS水凝膠的釋藥動力學，本文使用不同的模型對釋藥曲線進行擬合，得出了各模型的R2值，如表2所示。當R2值越趨近于1.000 00時，表示該模型對試驗數據的擬合程度越好。表2結果表明，SC-4V-5︰2在模擬胃液中BBR的釋放遵循一級動力學模型;SC-4V-5︰1在模擬傷口滲出液中BBR的釋放同樣遵循一級動力學模型。

綜上所述，4種SF/CMCS水凝膠在模擬胃液和模擬傷口滲出液中均具有藥物緩釋能力，且隨著環境的變化，累計釋放率也會受到影響。在模擬胃液中，SC-4V-5︰2最適合作為藥物緩釋載體，96 h時藥物的累計釋放率為74.93%;在模擬傷口滲出液中，SC-4V-5︰1最適合作為藥物緩釋載體，96 h時藥物的累計釋放率為57.65%。相較于部分已報道的SF基水凝膠藥物緩釋載體，本方法制備的水凝膠展現出可比擬的緩釋效果［34-35］。

3 結 論

本文采用電沉積法制備了絲素蛋白/羧甲基殼聚糖水凝膠，探究了不同制備參數下得到的水凝膠的微觀形貌、抗壓縮性能、細胞毒性和降解性能。并以BBR為藥物模型，分析了SF/CMCS水凝膠的體外藥物釋放行為，探究了SF/CMCS水凝膠作為藥物緩釋載體的可行性。得出如下結論：

1） 4種不同的SF/CMCS水凝膠均具有三維孔狀結構，且隨著制備電壓的升高及CMCS質量分數的增加，SF/CMCS水凝膠的孔徑呈現減小趨勢。

2） 4種不同的SF/CMCS水凝膠均表現出良好的抗壓縮力學性能，且隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，SF/CMCS水凝膠的抗壓縮力學性能增加。

3） 4種不同的SF/CMCS水凝膠均不具有細胞毒性。

4） 在模擬胃液、模擬傷口滲出液和模擬體液三個環境中，隨著CMCS質量分數的升高及制備電壓的增大，SF/CMCS水凝膠的穩定性增加，但在模擬體液中水凝膠的降解速率過快，不適合用作藥物緩釋載體。

5） 4種不同的SF/CMCS載藥水凝膠在浸入模擬胃液和模擬傷口滲出液時，在初期均發生一定程度的突釋，隨著釋放時間的延長，藥物釋放速率逐漸減慢，4種水凝膠均具有藥物緩釋作用。在模擬胃液中，SC-4V-5︰2最適合作為藥物緩釋載體;在模擬傷口滲出液中，SC-4V-5︰1最適合作為藥物緩釋載體。

相較于部分已報道的SF基水凝膠藥物緩釋載體，本方法制備過程無毒無污染，更加綠色環保，且制備得到的水凝膠展現出可比擬的緩釋效果。因此，本文在低電壓下制備的SF/CMCS水凝膠在藥物緩釋領域具有較大的應用潛力。

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