丹參酚酸B對Hela細胞增殖、遷移及凋亡的研究

王文瑾,張曉雨,劉保安,李 振

(臨沂大學 醫學院,山東 臨沂 276000)

宮頸癌是全球危害女性健康的第二大癌癥,我國每年約有100 000新發病例[1]。目前,臨床上治療宮頸癌的主要方法有手術、放療、化療、免疫及靶向治療等。但傳統的化療藥物不良反應較多,腫瘤細胞會不同程度地產生耐藥性,嚴重影響其臨床應用及療效,故而從天然產物中尋求不良反應少、毒性較低的防治藥物已成為研究熱點。

丹參酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是從丹參植物根莖中提取的縮酚酸類多羥基化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化,改善腎功能,促進纖維蛋白溶解,抗凝血、抗血栓及抗缺血損傷,防治心血管系統疾病,保護肝臟損傷,防治神經毒性等功能。近幾年,藥理學研究發現,丹參酚酸B對大腸癌細胞[2-3]、肝癌細胞[4]等具有較好的抑制效果,可有效逆轉大腸癌多藥耐藥,發揮減毒增效作用[5-6]。目前,關于SalB對宮頸癌Hela細胞抑制作用的研究未見報道。本研究探討了丹參酚酸B對Hela細胞增殖、遷移及凋亡的影響,為其進一步開發利用提供了科學理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

丹參酚酸B(成都儀捷睿生物科技有限公司生產)、人宮頸癌Hela細胞株(臨沂大學藥理學實驗室生產)、DMEM高糖(含丙酮酸鈉)(北京百奧萊博科技有限公司生產)、胎牛血清(Ausbian公司生產)、PBS緩沖液(Merck公司生產)、青霉素-鏈霉素溶液(Merck公司生產)、胰酶消化液(杭州浦泰生物科技有限公司生產)、噻唑藍(MTT)(Merck公司生產)、RPMI1640培養基(杭州銘特生物科技有限公司生產)、二甲基亞砜(細胞培養級)(新睿生物科技有限公司生產)、細胞培養板(北京索萊寶科技有限公司生產)、細胞培養瓶(北京索萊寶科技有限公司生產)。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱(萊特科學儀器有限公司生產)、SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化生產設備有限公司生產)、離心機(湖南恒諾儀器設備有限公司生產)、倒置顯微鏡(奧林巴斯株式會社生產)、超低溫冰箱(濟南好來寶醫療器材有限公司生產)、電子天平(梅特勒托利公司生產)、DHG-9035A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海—恒科技有限公司生產)、流式細胞儀(美國BD Biosciences公司生產)、凋亡檢測試劑盒(美國BD Biosciences公司生產)、全波長酶標儀(北京普天新橋技術有限公司生產)、LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠生產)。

2 實驗方法

2.1 Hela細胞的復蘇和培養

取凍存的宮頸癌Hela細胞株,用常規方法復蘇后,將Hela細胞培養在DMEM完全培養基(含90%DMEM培養基、10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素)中,于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養3～4 d,細胞生長到對數期,采用胰蛋白酶消化液(0.25%)處理,制成Hela細胞懸液。

2.2 SalB對Hela細胞增殖的影響

采用MTT法,測定Hela細胞增殖情況。將對數期Hela細胞(2×104/mL)按100 μL/孔接種到細胞培養板中,置于37 ℃、5%CO2培養箱中,培養24 h,分別加入SalB,使其濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL,每組設置5個重復,并保留空白對照組,培養Hela細胞72 h后,加入20 μL濃度為5g/L的MTT溶液,繼續培養Hela細胞4 h,棄去上清液,以每孔150 μL加入DMSO溶液,搖床振蕩10 min,用全波長酶標儀測定Hela細胞培養液在490 nm波長處的吸光度值(A)[7]。計算Hela細胞增殖抑制率,Hela細胞增殖抑制率(%)=[(A空白對照組-A實驗組)/A空白對照組]×100%。

2.3 SalB對Hela細胞遷移抑制率的影響

取對數生長期Hela細胞,接種于細胞培養板,培養24 h,貼壁,細胞生長至100%,每孔用滅菌槍頭做3條平行劃痕,PBS清洗3遍,除去劃下的懸浮Hela細胞,用倒置顯微鏡對劃痕拍照,以含2%胎牛血清培養基配制不同濃度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL)SalB,培養細胞24 h,對劃痕進行拍照,采用Image J軟件,計算細胞培養板各組劃痕面積S,并計算Hela細胞遷移抑制率[8]。Hela細胞遷移抑制率(%)=[1-(S0h-S24h)/S0h]×100%。

2.4 SalB對Hela細胞凋亡率的影響

取對數生長期Hela細胞,接種于細胞培養板,過夜培養,貼壁。分別加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用48 h,收集Hela細胞。采用凋亡試劑盒進行染色,以流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率[9]。

3 實驗結果

3.1 MTT法檢測SalB對Hela細胞增殖的影響

MTT法檢測SalB對Hela細胞增殖的影響,實驗結果見表1。當SalB濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL時,對Hela細胞增殖均具有抑制作用,細胞增殖抑制率分別為56.56%、66.84%、70.98%、75.90%、83.40%、91.31%、95.70%,且隨SalB濃度的增加,細胞增殖抑制率不斷升高。

表1 SalB對Hela細胞增殖的影響

3.2 SalB對Hela細胞遷移抑制率的影響

劃痕實驗測定SalB對Hela細胞遷移抑制率的影響,實驗結果如表2所示。結果表明,分別用0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mLSalB處理Hela細胞24 h后,SalB對Hela細胞遷移的抑制率分別為51.20%、67.00%、73.00%、79.10%、89.50%、96.10%、98.70%,0.15 mg/mL的SalB處理Hela細胞,能明顯抑制細胞的遷移能力。但當SalB濃度增加到0.15 mg/mL后,SalB對Hela細胞遷移抑制作用增加不明顯。

表2 SalB對Hela細胞遷移抑制率的影響

3.3 SalB對Hela細胞凋亡率的影響

采用流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率,實驗結果見表3。分別用0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用Hela細胞48 h后,細胞凋亡率分別為1.06%、3.79%、9.64%、14.47%、23.23%、30.18%、37.25%、41.32%。說明SalB可促進Hela細胞的凋亡,且隨著SalB濃度的增加而不斷增強。

表3 SalB對Hela細胞凋亡率的影響

4 討論

丹參是常用的傳統中藥,含有二萜醌類、酚酸類及其他類化合物,具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等作用。研究發現,丹參酮ⅡA可抑制腫瘤細胞生長、侵襲、遷移、誘導凋亡及分化[10]。王冬[11]等采用細胞體外培養方法,取0～8.0 μg/mL濃度的丹參酮ⅡA作用Hela細胞72 h,可明顯抑制并誘導宮頸癌細胞凋亡。沈雋[12]等報道,丹參酮ⅡA能加快HeLa細胞凋亡,用藥48h后,可使Bcl-2基因mRNA的表達水平明顯降低,CX43表達上調,SKP2表達減少[13]。

丹參素是丹參的主要有效成分。唐艷[14]等報道,丹參素濃度在20～100 μg/mL時,能抑制Hela細胞增殖,降低Hela細胞遷移能力。湯中杰[2]等在前期體、內外研究中發現,丹參酚酸B具有明確的抗癌作用。這與本研究結果一致。在一定濃度范圍內,丹參酚酸B量效相關性抑制大腸癌LOVO細胞生長,濃度依賴性抑制LOVO細胞SOX2OT表達,抑制LOVO細胞侵襲轉移[2]。郭飄婷[15]等研究發現,SalB能促進大腸癌HCT-116細胞內ROS水平,阻滯細胞周期于G0/G1期,進而量效相關性抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。丹參酚酸B可作為自噬誘導劑,通過PI3K/Akt通路抑制,抗結直腸癌細胞[16],使肝癌SMMC7721和HepG2細胞的AT1R表達下調,VEGF的分泌減少,以旁分泌的形式作用于血管內皮細胞,從而影響腫瘤血管的生成[17]。Yang[18]等報道,丹參酚酸B對口腔鱗狀癌細胞生長抑制作用機制可能與腫瘤血管的生成過程中某些關鍵調控基因的表達減少有關。但關于SalB抑制宮頸癌Hela細胞的作用機制未見報道,有待進一步研究。

5 結論

實驗結果表明,SalB對宮頸癌Hela細胞增殖具有良好的抑制作用,并影響Hela細胞遷移率,誘導其凋亡。該研究可為進一步探討其抗腫瘤作用機制及臨床應用提供科學的理論依據。