2 種委陵菜總黃酮提取工藝研究

于 波 徐昕萍 張 越 李一鳴 曹 燕 趙曉菊 張奕婷

（大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江大慶 163712）

光叉委陵菜（Potentilla bifurcavar.glabrata）和翻白委陵菜（Potentilla discolor）均為薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬（Potentilla）多年生草本植物，耐鹽、抗干旱能力較強[1-2]，多生于草甸沙地或山坡、林緣、灌叢等環(huán)境，分布于我國多個省市。翻白委陵菜具有消腫止血、清熱解毒的功效，有較高的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[3]。研究發(fā)現(xiàn)，翻白委陵菜含有的黃酮類物質(zhì)對治療多種疾病均有較好的療效[4-5]，具有降血糖、抗菌、抗氧化等功效[6-7]。目前，對光叉委陵菜的研究相對較少，為進(jìn)一步促進(jìn)委陵菜屬植物的開發(fā)與利用，本試驗對光叉委陵菜和翻白委陵菜中總黃酮提取工藝進(jìn)行了研究，以期為委陵菜屬植物的進(jìn)一步綜合利用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及藥品

試驗所用的光叉委陵菜和翻白委陵菜于2022年7 月采自大慶師范學(xué)院校園內(nèi)，取其地上部分清洗干凈，60 ℃烘干后粉碎研磨成粉狀，過60目篩，過篩后的粉末盛于棕色廣口瓶，備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所，試驗所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

高速萬能粉碎機（上海啟前電子科技有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、超速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）、可見光分光光度計（上海精密儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）、微波爐（廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取流程稱取委陵菜粉末置于100 mL錐形瓶中，按料液比1∶40（g/mL）加入40%乙醇溶劑，置室溫浸泡12 h，超聲震蕩12 min后轉(zhuǎn)入微波爐高火20 s，70 ℃恒溫水浴浸提2 h，冷卻至室溫，4 000 r/min 離心去除沉淀，上清液使用無水乙醇定容至100 mL作為提取樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照鄭明蘭[8]的方法，稍作改動。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品5 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL，制得0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL至25 mL比色管內(nèi)，分別加入5% NaNO2試液1.0 mL，搖勻靜置6 min，再加10% AlCl3試液1.0 mL，搖勻靜置6 min，最后加入1 mol/L NaOH 溶液10 mL，用超純水定容。以蒸餾水代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液作為空白對照，測定比色管內(nèi)溶液500 nm 處的吸光光度值，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)繪制出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），通過Origin軟件計算得到回歸方程為Y=0.309 86X+0.017 22，R2=0.992 88，蘆丁濃度在0.10~0.65 mg/mL時線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 總黃酮提取率計算吸取待測樣品1 mL于25 mL 比色管內(nèi)，按1.3.2 方法測定其吸光光度值，根據(jù)回歸方程計算出樣品的總黃酮濃度，計算獲得總黃酮提取率。總黃酮提取率計算公式如下：

式中，Φ為委陵菜中總黃酮提取率，%；C為樣品中總黃酮濃度，mg/mL；V為無水乙醇定容的樣品體積，mL；M為委陵菜樣品質(zhì)量，mg。

1.4 單因素試驗

分別考察浸提溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）、浸提時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、超聲時間（3、6、9、12、15、18、21 min）、微波時間（5、10、15、20、25、30、35 s）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45）和乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）6 個因素對總黃酮提取率的影響。

1.5 正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，每個因素取3 個水平，采用7因素3水平L18（37）正交表進(jìn)行正交試驗，以獲得光叉委陵菜和翻白委陵菜較優(yōu)的總黃酮提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.1 浸提溫度如圖2所示，2種委陵菜總黃酮提取率隨著浸提溫度的升高逐漸升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分別在浸提溫度為50、60 ℃時，總黃酮提取率最高，達(dá)到峰值后，提取率逐漸降低。

圖2 浸提溫度對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.2 浸提時間如圖3所示，2種委陵菜總黃酮提取率隨著浸提時間的增加逐漸升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分別在浸提時間為1.5、2.0 h 時，總黃酮提取率最高，達(dá)到峰值后，提取率逐漸降低，2.5 h后下降趨勢比較平緩。

圖3 浸提時間對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲時間如圖4 所示，光叉委陵菜在超聲時間為9 min 時，總黃酮提取率達(dá)到峰值，隨后總黃酮提取率下降；翻白委陵菜在超聲時間為18 min時，總黃酮提取率達(dá)到峰值。

圖4 超聲時間對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.4 微波時間如圖5 所示，2 種委陵菜總黃酮提取率隨微波時間的增加逐漸升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分別在微波時間為15、25 s 時，總黃酮提取率達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢。

圖5 微波時間對2 種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.5 料液比如圖6 所示，2 種委陵菜總黃酮提取率隨料液比增加的變化趨勢一致，光叉委陵菜總黃酮提取率高于翻白委陵菜，在料液比為1∶35 時，2 種委陵菜總黃酮提取率達(dá)到峰值。

圖6 料液比對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.1.6 乙醇濃度如圖7 所示，2 種委陵菜總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加逐漸升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分別在乙醇濃度為70%、60%時，總黃酮提取率達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢。

圖7 乙醇濃度對2種委陵菜總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取浸提溫度、浸提時間、超聲時間、微波時間、料液比、乙醇濃度6 個因素，每個因素取3水平作正交試驗（表1、表2）。以總黃酮提取率為指標(biāo)，按照L18（37）正交設(shè)計進(jìn)行試驗，確定最佳提取條件，試驗結(jié)果見表3~6。

表1 光叉委陵菜正交設(shè)計因素與水平

表2 翻白委陵菜正交設(shè)計因素與水平

表3 光叉委陵菜總黃酮提取正交試驗結(jié)果

由表3 得出，各因素對光叉委陵菜總黃酮提取率的影響程度依次為F>A>C>B>E>D。由表4 得出，F(xiàn)、A、C 3個因素影響顯著，B、E、D 3個因素影響不顯著。最佳的提取工藝條件為A3B2C2D2E2F2，即浸提溫度60 ℃、浸提時間1.5 h、超聲時間9 min、微波時間15 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇濃度70%。

表4 光叉委陵菜總黃酮提取正交試驗方差分析

由表5 得出，各因素對翻白委陵菜總黃酮提取率的影響程度依次為F>B>A>D>C>E。由表6得出，F(xiàn) 因素影響顯著，其余因素影響不顯著。最佳的提取工藝條件為A1B2C1D2E2F3，即浸提溫度50 ℃、浸提時間2 h、超聲時間15 min、微波時間20 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇濃度70%。

表5 翻白委陵菜總黃酮提取正交試驗結(jié)果

表6 翻白委陵菜總黃酮提取正交試驗方差分析

2.3 驗證性試驗

為了驗證光叉委陵菜和翻白委陵菜總黃酮的最佳提取工藝，測定2 種委陵菜的總黃酮提取率，結(jié)果表明最佳提取工藝條件下，光叉委陵菜的總黃酮提取率為4.92%、翻白委陵菜的總黃酮提取率為3.81%，與正交試驗結(jié)果相近。

3 結(jié)論

以光叉委陵菜和翻白委陵菜為材料，采用單因素和正交試驗法優(yōu)化了2種委陵菜總黃酮的提取工藝，得到光叉委陵菜總黃酮的最佳提取工藝條件為浸提溫度60 ℃、浸提時間1.5 h、超聲時間9 min、微波時間15 s，料液比1∶35（g/mL）、乙醇濃度70%；翻白委陵菜總黃酮的最佳提取工藝條件為浸提溫度50 ℃、浸提時間2 h、超聲時間15 min、微波時間20 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇濃度70%。在最佳提取工藝條件下，光叉委陵菜和翻白委陵菜總黃酮提取率分別為4.92%、3.81%，光叉委陵菜中黃酮類成分更為豐富，具有良好的藥用開發(fā)價值。