櫟屬植物組織培養研究現狀

羅珍珍 張嬋嬋 劉瀟陽 高 瑞

（1榆林市林木種苗工作站，陜西榆林 719000；2榆林市林業科學研究所，陜西榆林 719000；3榆林市草原工作站，陜西榆林 719000；4麻黃梁黃土地質公園開發建設中心，陜西榆林 719000）

櫟屬樹種種類豐富，分布范圍廣，具有重要的生態價值和經濟價值。廣義的櫟屬包括青岡亞屬，狹義的櫟屬僅包括櫟亞屬，即Camus[1]定義的櫟亞屬，中國分布有60余種[2]。櫟屬植物分布于我國各地，普遍為森林組成樹種[3]。櫟屬樹種普遍具有良好的木材品質，可以用于家具或作為優質建材使用，其果實、葉片還可用作飼料等[4]。櫟樹在工業原料、生態恢復、家具用材、環境美化等方面有顯著的功效及經濟價值。

根據統計，運用組織培養技術已獲得1 500多種的再生植物，累計130 多科[5]，其中有涵蓋了果樹的400多種的木本植物，且數量依舊在不斷遞增[6]。組織培養已被應用于櫟屬植物的多個物種（見表1）。

表1 部分櫟屬植物組織培養情況

1 外植體選取

組織培養合理挑選外植體是特別重要的一步，需要挑選有較強分化能力的材料，進而確保可以成功進行組培。造成組培植物生理形態差異的因素主要有外植體的基因型、親本材料的年齡、生長環境，以及發育時期、取材季節、取材部位、天氣現狀等[21]。

外植體的基因型影響組培效果。張存旭[8]以4 株栓皮櫟的未成熟合子胚作為外植體進行體胚誘導，研究發現母樹基因型對體胚誘導率有顯著影響。魏爽[11]在遼東櫟母樹基因型試驗中也發現，不同母樹基因型體胚發生頻率差異較大。

不同的取材區域也存在不同的誘導成效。唐羅忠等[22]分析和對比了種胚、去皮種子、嫩枝、幼嫩莖、一年生木質枝條等的組培成效，結果表明，嫩枝和嫩莖有良好的成效，試驗過程中污染少、組培苗成活率比較高、小苗生長和發育迅速。蘇瑪櫟自然條件下萌發的枝條，無論是頂芽還是帶腋芽的莖段，都存在非常嚴重的污染與褐變情況，沒有通過離體培養獲得再生植株[14]。Vengadesan等[18]將從體外生長8周齡的幼苗上切下的子葉節作為外植體，通過叢芽誘導，成功對北美紅櫟枝條進行了體外繁殖。通過對栓皮櫟未成熟合子胚、葉片、莖段3種外植體的體胚誘導比較發現，未成熟合子胚的體胚誘導率累計57.8%，和莖以及葉片的誘導率有顯著差異，莖的誘導成功率為25%，葉片的體胚誘導率為35%[4]。

能否成功進行組織培養的主要影響因素之一為取材階段，具體取材時期因樹種而異。成齡栓皮櫟要想獲得較好的組培效果，最佳采集外植體的階段為3月上旬至4月上旬，在這期間采集外植體進行試驗，萌芽率超過90%[23]。4—5月采集的大樹嫩枝，污染率低、萌芽率高，為最適合采集大樹嫩枝的階段；采集幼苗莖段的階段為4 月和6 月，只有13.1%、14.3%的污染率，實現了74.7%、72.1%的萌芽率[22]。8 月上旬為遼東櫟體胚誘導的最佳采樣時間，此時未成熟合子胚體胚誘導率最高，為88.7%，與其他時期相比，誘導產生的體胚生長健壯、整齊[11]。

2 培養基選擇

研究表明，夏櫟在WPM、BTM 培養基內，比在GD、MS 培養基中有更大的誘導率，且生長更好；MS 培養基的誘導率較低，為10%~25%，GD 培養基內，誘導的嫩芽較短時間就枯死[24]。谷櫟叢芽誘導研究表明，基礎培養基對外植體的芽誘導數有顯著影響，BTM 和GD 培養基上誘出的芽總體上生長健壯，而在WPM 培養基上的芽通常萎黃[25]。李文文等[26]在基本培養基對蒙古櫟腋芽啟動和生長的影響試驗中發現，1/2 MS 培養基比BTM 和MS 培養基更有利于腋芽的啟動和生長，腋芽在BTM 和MS 培養基上啟動時間長，芽生長情況差，不伸長，后期直接枯死；而在1/2 MS培養基中啟動時間最早，有效芽數量最多，芽生長最為健壯，平均長約3.00 cm，最長5.20 cm；在WPM 培養基上生長狀況一般。呂秀立等[14]以MS、1/2 MS、WPM 為基礎培養基，發現試管苗在WPM培養基中比在MS、1/2 MS培養基上生長更好，在MS、1/2 MS 培養基的試管苗均生長較差，苗發黃莖細弱，生長一段時間后逐漸衰弱。由此可見培養基中某些元素的含量以及種類對櫟屬組培苗的生長有明顯影響。

在同一樹種不同誘導途徑的試驗中，同一基本培養基的誘導效果千差萬別，因此不同誘導途徑對基本培養基的選擇也會不同。栓皮櫟莖段的離體培養選用低鹽培養基WPM、BTM、GD 比高鹽培養基MS誘導產生的叢生芽多，莖粗壯[27]，胚軸伸長快，誘導率也較高[8]。于艷等[28]在研究麻櫟的不定芽誘導時發現，選用1/4 MS（2倍鐵鹽）作為基本培養基時，誘導效果比MS、WPM培養基更好，誘導率達86.7%，且褐化率僅為5.0%。廖婧[29]利用麻櫟成熟合子胚進行體胚誘導時發現，MS基本培養基的誘導效果好于WPM基本培養基。MS培養基的主要特點是無機鹽和離子濃度高，含有微量元素種類多，可以促進體胚發生[30]。

同種材料處于初代培養、繼代培養、生根培養等不同階段時所用培養基也有所不同。研究認為低鹽培養基更利于組培苗生根，因此在生根階段所用培養基的大量元素含量可以在原來的基礎上減半。在BMT 培養基中開展大葉櫟繼代培養，單芽生根試驗在1/2 BMT培養基中開展和實施[31]。遼東櫟誘導叢生芽以及增殖芽的最佳培養基為MS培養基，增殖系數高達4.3，生根培養環節應用了降低大量元素含量的1/2 MS 培養基，不定芽生根率最高達77.8%[11]。蘇瑪櫟在1/2 MS基本培養基上初代培養，繼代培養在WPM培養基上生長情況更好，試管外生根率高達80%[14]。北美紅櫟的子葉節在MS 培養基上的誘導率達到64.7%，而芽增殖和伸長在WPM 培養基上達到最佳，最高為73.3%[18]。蒙古櫟促萌莖段的離體培養過程中，在WPM 培養基上初代培養比在MS 和1/2 MS培養基上效果更好，腋芽生長伸長明顯，產生的叢生芽更多[12]。

3 植物生長調節劑對組織培養的影響

植物生長調節劑的使用視具體情況而定，相同或不同植物途徑不同其應用的植物生長調節劑的濃度、種類等也有顯著的差別。

在成齡栓皮櫟的芽誘導中，6-BA是最利于芽誘導的細胞分裂素，過高濃度的6-BA促使植株形成愈傷組織，但會導致植株生長異常，0.2 mg/L的濃度最有利于成齡栓皮櫟芽誘導[23]。體細胞胚胎發生過程中不同階段需要添加不同的植物生長調節劑。張存旭[8]在栓皮櫟體胚誘導研究中發現，在繼代過程中，添加1.0 mg/L 6-BA 和0.25 mg/L NAA 更有利于體胚的增殖。趙丹[9]在誘導麻櫟腋芽萌發時發現，當培養基中添加1.0 mg/L 6-BA 時，腋芽顏色深綠，長勢較好；在進行芽增殖時，相同濃度處理水平下，使用生長素NAA 的增殖系數均比用IBA 的增殖系數大；而對于細胞分裂素，6-BA 增殖效果要好于KT，濃度為1.0 mg/L 時，叢生芽長勢最好，6-BA 對麻櫟幼苗莖段芽的增殖生長起決定性作用，1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA是幼苗莖段增殖的最佳組合。麻櫟葉片誘導愈傷組織使用生長素2，4-D的效果要好于NAA，最佳濃度為1.5 mg/L。廖婧[29]將麻櫟成熟合子胚作為外植體，在體胚誘導中，將1.0 mg/L 6-BA與1.0 mg/L IBA 組合，獲得最佳誘導效果；將莖、葉作為外植體的體胚誘導中，又添加了0.1 mg/L TDZ。呂秀立等[15]利用蘇瑪櫟的莖、葉作為外植體，在MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT 的組合中獲得了較多的愈傷組織；而在增殖過程中，3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的培養效果最好。歐洲栓皮櫟的葉片用于體胚誘導中，1.0 mg/L 2，4-D 與2.0 mg/L ZT 組合獲得了較高的誘導率[17]。對于蒙古櫟叢生芽的誘導，0.5 mg/L 2，4-D和6-BA一起使用誘導率達到76.7%，誘導效果最好；而在增殖階段，0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA是最佳組合，增殖系數可達到3.5[12]。6-BA作為有效的細胞分裂素，具有良好的誘導芽形成的能力，因此在增殖培養過程中，提高其濃度，有利于形成較多數量的叢生芽。

除了6-BA、2，4-D、NAA、IBA 等常用的植物生長調節劑，在有些試驗中也會加入GA3、ABA等。北美紅櫟以子葉節為外植體進行誘導時，WPM中添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L GA3的誘導效果好于MS添加6-BA和TDZ，芽誘導率高，誘導的叢芽數量多[18]。Purohit 等[32]也提出，雖然1.0 mg/L GA3可以協同6-BA進一步提高芽誘導數量與芽高度，但會使芽生長細弱。張存旭[8]在進行栓皮櫟體胚的成熟培養時，在MS培養基中加入了ABA，體胚的成熟率提高了3倍以上，低濃度的ABA（0.5 mg/L）使成熟體胚子葉明顯伸長變綠，偶有體胚會產生胚根。

4 生根培養

目前，生根培養是植物組織培養的一個難題。與作物相比，林木生根難度更大。因此，生根培養的難題是木本植物組織培養必須要重視的問題。

在生根培養中，適當降低培養基中礦質元素濃度，生長調節劑只添加生長素，提高蔗糖濃度是誘導生根最常用手段。魏爽[11]在遼東櫟的生根培養中發現，在蔗糖濃度為30 g/L時，叢生芽在1/2 MS培養基中的生根情況比MS 更好，生根率提高了40%，平均根長為3.8 cm，且根系長勢很好；蔗糖濃度主要影響根的粗度和長度，蔗糖濃度為20 g/L時，盡管有健碩的根系，但平均根長度只有2.5 cm，葉片發黃，苗情不好。張存旭等[27]表示應用NAA進行生根誘導中，伴隨濃度的提高其生根率也表現出逐漸遞增的發展態勢，首先在IBA 濃度為0.5 g/L 的溶液內浸泡1 min，隨后轉入空白培養基，僅需很短的出根時間，根長而粗壯，大多有側根，但生根率很低，并且在莖段區域有很大的愈傷塊；在培養基內添加1.0 mg/L IBA 的處理，芽基部愈傷比前一處理小，生根率較高，苗生長正常，但形成的根數偏少。0.1 mg/L NAA+0.25 mg/L IBA 的組合最有利于栓皮櫟生根，生根率高，根系質量好。丁世民等[13]得出誘導沈氏櫟試管苗生根的最佳組合是1/2 MS+0.4 mg/L NAA，生根率最高為97.7%，每莖段平均生根2.93 條，1/2 MS 比MS 與1/4 MS 更適合沈氏櫟生根，當NAA濃度超過0.4 mg/L 后，生根率和平均生根條數反而降低。在蒙古櫟芽苗的生根培養中，1/4 MS 培養基添加20 g/L 蔗糖時，大部分芽苗枯黃、死亡，而添加30 g/L 蔗糖更有利于芽苗生長，能促進生根[26]。添加0.1 mg/L IBA＋0.5 mg/L NAA 的1/2 MS培養基為蒙古櫟莖段的最佳生根培養基，生根率達到76.7%，每個單株的平均根數可以達到4.3 條，NAA 濃度超過0.5 mg/L 后生根率降低，表明較高的NAA 濃度會抑制生根[12]。于艷[28]在麻櫟組培體系優化研究中發現，生根培養時NAA 處理后長出的根多為愈傷根，移栽不易成活，IBA比NAA更有利于麻櫟小苗生根。Chalupa[20]研究發現，材料越幼嫩越利于生根，影響生根的因素中基因型的影響力大于基本培養基與植物生長調節劑，12 個不同無性系的生根率為14%~86%。

此外，生根還有一步生根法、兩步生根法等。北美紅櫟的變種就用了兩步生根法，先將1.5~2.0 cm的繼代芽接入到含25 mg/L IBA 的1/2 WPM 培養基中培養48 h，之后轉移到不含植物生長調節劑的1/2 WPM+4 g/L AC 培養基中，轉接后不需要進行暗處理，多個變種的生根率達到70%~90%[19]。

5 存在的問題與解決方法

5.1 污染

櫟屬組織培養中存在污染問題，造成污染的原因有許多，對污染原因的研究多是關于材料取材時期、消毒時間、外植體類型等。楊鋒利[23]從3—7 月每個月對栓皮櫟母株取材，在早春3 月上旬采集的成齡莖段誘導的嫩枝做外植體誘導培養的效果最好，污染率只有6.6%，萌發率達96.7%，夏季7 月采集的莖段培養的外植體誘導效果最差，污染率達56.7%，萌發率僅為63.3%。這主要是因為3 月份外植體處于休眠后期，即生長停止，營養物質積累，即將進入萌發期，生理活性水平升高；同時此時氣溫低，雨水少，病菌等不易滋生，材料不易污染。消毒時間的選擇也很重要，消毒時間短不能有效殺死病菌，消毒時間過長時，消毒更徹底，污染率較低，但同時對植株的毒害作用較嚴重。栓皮櫟種子在0.1%升汞中消毒25 min，對胚的誘導效果最好；而胚根消毒4 min效果最好[23]。用麻櫟的去皮種子、大樹1年生木質化枝條和胚作為外植體，污染率分別為70%、75%、50%，且萌發情況不好，死亡率較高，而選用種子萌發的幼苗和麻櫟大樹嫩枝作為外植體，污染率分別為5.0%、23.8%，萌發率分別為50%、70.7%，試驗效果較好[9]。

5.2 褐化

導致櫟屬植物培養材料褐變的因素很多，外植體的基因型不同、材料本身的生理性狀不同都會影響外植體的褐化。防止褐變的主要措施有選擇分生能力較強的材料作為外植體，在培養基中加入活性炭等抗褐化劑，在培養初期進行連續轉移等。

在組織培養防止褐化的研究中，抗褐化劑主要有維生素C、硝酸銀（AgNO3）等[33]。劉光金等[34]發現，在不添加AC與維生素C的培養基上大葉櫟的褐化率高達80%，而在培養基中添加1.0~3.0 g/L AC或0.1~0.3 g/L 維生素C 之后褐化率降低至42.5%~58.3%。丁彤[35]研究表明，AgNO3、PVP、Na2S2O3、AC這4種抗褐化劑中，Na2S2O3抗褐化效果最好，在培養基中添加200 mg/L Na2S2O3的處理可將北美紅櫟的褐化/死亡率降低至20%。李文文等[26]在培養基中添加0.2 g/L PVP能有效抑制蒙古櫟外植體褐化，褐化率和褐化程度都明顯降低。另外，于艷等[36]研究認為，選用5 年生實生苗幼嫩莖段作為外植體，0.1%HgCl2溶液表面消毒7 min 后接入誘導培養基，在初代培養前期暗培養5~7 d，褐變死亡率可降至5%以下。

6 展望

櫟屬植物組織培養除了少數樹種組培技術比較成熟之外，依舊有很多樹種目前處于探索時期，獲得成功的樹種普遍是將幼嫩材料作為外植體，而老齡樹則很難，關鍵的問題為：①誘導培養時，污染與褐化嚴重；②繼代培養時，玻璃化及褐化現象普遍存在；③生根培養時，器官培養生根困難，體胚發生萌發階段也會出現生根困難等問題。

木本組織培養研究目的主要是進行優良種質無性化推廣。要打破木本植物組織培養技術的瓶頸，下一步研究關鍵包括以下幾個方面：①優良單株的高效幼化技術。通過對成齡材料進行修剪、誘導根萌條，能夠有效提高成齡材料的組織培養效果。②基本培養基礦質元素、有機物質等的優化調控，可提高增殖效果及芽的質量。目前的研究試驗中使用的培養基多為WPM、BMT、MS等固定元素含量的基本培養基，部分研究中會將這些培養基的礦質元素含量降為1/2或1/4，受經驗和技術水平的限制，大部分試驗中都沒有對其中元素進行調配。這也是今后的一個研究方向。③以成年優樹為母本材料的體細胞胚胎發生技術。大樹葉誘導體胚的成功，對于經遺傳測定的優良基因型的擴繁具有重要意義；合子胚等幼年組織誘導率可達100%，而成年材料誘導率一般僅有20%[8]，因此，成年材料體細胞胚胎發生技術的優化提升也是未來研究的一個方向。

櫟屬植物的組織培養研究還有很大的發展空間，其技術研究有待進一步深入，褐變、玻璃化、生根等技術難題需要科研人員更多的努力，才能取得新的突破。隨著櫟屬組織培養技術的成熟及其在櫟屬植物育種和遺傳轉化中的廣泛應用，櫟屬植物的經濟價值、生態價值和園林應用價值也將得到更大程度的發揮。