火針對膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清TNF-α及軟骨組織p38的影響 *

萬 甜 藍枰英 石欣悅

（1.福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院康復醫(yī)學科，福建 泉州 362000；2.福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福建 福州 350122）

骨性關(guān)節(jié)炎是一種好發(fā)于中老年人的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，我國65 歲以上人群的患病率高達50%，其病變可累及多個部位，其中以膝關(guān)節(jié)受累最為多見［1］。膝骨性關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis，KOA）臨床癥狀以膝關(guān)節(jié)局部疼痛腫脹、活動受限為主［2］，晚期可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，對患者軀體、心理、社會等方面的功能及物質(zhì)生活狀態(tài)造成明顯負面影響［3］，故在疾病早期積極采取保守治療措施，延緩關(guān)節(jié)退變?yōu)榧选；疳樣置按愦獭薄盁槨保轻樉寞煼ㄖ械囊环N，有研究［4，5］表明，火針在緩解疼痛、提高關(guān)節(jié)功能、消除患者負面心理、優(yōu)化生活質(zhì)量等方面效果均優(yōu)于普通毫針刺法，且療效持續(xù)時間更長［6］，安全性良好［7］，但其具體的起效機制仍未完全明確，還在進一步探索中。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）在生物體信號傳導過程中扮演著重要角色，諸多研究表明MAPK 的4 個亞族之一的p38 與KOA的發(fā)生密切相關(guān)［8］，而腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為病程中最重要的炎癥介質(zhì)之一，能與多條信號通路協(xié)同作用，促使軟骨基質(zhì)降解，加重關(guān)節(jié)軟骨破壞［9］。目前基于MAPK 信號轉(zhuǎn)導通路研究火針干預KOA 的作用機制及靶點的報道相對匱乏。故本研究基于MAPK 信號通路，觀察火針干預內(nèi)膝眼、犢鼻穴對KOA 模型大鼠血清TNF-α 及軟骨組織內(nèi)p38 mRNA 的影響，進一步探討火針治療KOA 的作用機制，以期為臨床中使用火針治療KOA提供實驗和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠15 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2019-0008。分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，進食飲水不做限制。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，抽簽法將大鼠隨機分為空白組、模型組與火針組，每組5只。

1.2 主要試劑與儀器木瓜蛋白酶，來自上海麥克林生化科技有限公司；大鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒，來自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TransZol Up，TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synhesis SuperMix for qPCR，PerfectStart?Green qPCR SuperMix（+Dye II）均由北京全式金有限公司提供；qPCR 引物，委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。多功能酶標分析儀（Infinite 200Pro），來自瑞士Tecan；全自動酶標洗板機（PW-812），深圳匯松科技發(fā)展有限公司；高速低溫離心機（Centrifuge 5424R），來自Eppendorf中國有限公司；微量紫外-可見光分光光度計（NanoDrop? One）、熒光定量PCR 儀（ABI QuantStudio 3），來自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法采用木瓜蛋白酶法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型［10］，于適應(yīng)性喂養(yǎng)后的第1、4、7天用異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，R510-22-10）麻醉動物后，向模型組與火針組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶0.2 mL。最后1次造模結(jié)束后正常飼養(yǎng)2周，造模大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動量、食量明顯降低，與空白組對比膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、骨性標志變淺且對局部疼痛刺激有明顯反應(yīng)等癥狀提示造模成功。

1.3.2 干預方法黑襪套住大鼠頭部及軀干，仰臥位固定于自制大鼠固定板，使雙后肢呈自然屈曲狀態(tài)。火針組采用針灸針（廠家：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，蘇械注準20162200970，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）點刺，取雙側(cè)內(nèi)膝眼、犢鼻穴，穴位定位參考《實驗針灸學》［11］，穴位局部以碘伏消毒并起定位作用，將針身前1/3 于酒精燈上燒至發(fā)白后迅速點刺穴位，深度約2 mm，疾進疾出，出針后按壓針孔片刻。隔日干預1 次，共治療2 周。空白組與模型組于干預日同方法抓取固定。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 取材方法（1）麻醉：用異氟烷麻醉動物。（2）腹主動脈采血：確定大鼠被徹底麻醉后，將其置于操作臺，腹部朝上，用手術(shù)剪打開腹腔，無菌紗布撥開內(nèi)臟，見腹主動脈充分顯露后，左手托起大鼠背部使其微微后仰，右手進行采血操作，收集動脈血約5 mL，室溫靜置1 h，離心機預冷至4℃后放入各樣品，離心15 min（轉(zhuǎn)速：3500 r/min，離心半徑：65.5 mm），取上清液，分裝后-80℃保存。（3）取膝關(guān)節(jié)軟骨組織：逐層剝離大鼠后肢皮膚、肌肉、韌帶等組織，打開大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)，手術(shù)刀刮取脛骨平臺與股骨髁軟骨組織碎片至EP管，置于液氮中備用。

1.4.2 指標檢測方法（1）ELISA 法檢測大鼠血清TNF-α 含量：取出低溫保存的血清樣品，室溫自然化凍后再次離心，充分混勻各試劑，按大鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒說明書操作。（2）qPCR 法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)p38 mRNA 表達：軟骨組織液氮研磨，提取總RNA、配制反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系及qPCR 反應(yīng)體系均嚴格按相關(guān)試劑盒說明書進行；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃孵育15 min、85℃滅活5 s，產(chǎn)物cDNA 用于后續(xù)p38 qPCR 反應(yīng)，于ABI QuantStudio 3 熒光定量PCR 儀上進行，反應(yīng)程序設(shè)定為94 ℃ 30 s 后接94 ℃ 5 s、60 ℃30 s 循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)部參照，上游引物為5'ACGGCAAGTTCAACGGCACAG 3'，下 游 引 物 為5'GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC 3'；大鼠p38 上游引物為5' TGTGATTGGTCTGTTGGATGT 3'，下游引物為5'GGATTATGTCAGCCGAGTGTAT 3'。p38 mRNA 相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.4.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析處理用SPSS 23.0 軟件進行。計量資料若符合正態(tài)分布且通過方差齊性檢驗，選用單因素方差分析，LSD 法進行組間比較；若符合正態(tài)分布但未通過方差齊性檢驗，則選用Games-Howell 法進行組間比較，均用（±s）描述。不符合正態(tài)分布的計量資料采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠血清TNF-α含量比較造模4 周后，模型組大鼠血清TNF-α 水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；火針組經(jīng)療程干預，大鼠血清TNFα 含量已接近空白組水平（P＞0.05），與模型組對比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠血清TNF-α比較 （± s，pg/mL）

表1 3組大鼠血清TNF-α比較 （± s，pg/mL）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與空白組比較，2）P＞0.05。

TNF-α 248.21±5.051）285.60±5.31 249.99±8.021）2）組別空白組模型組火針組鼠數(shù)555

2.2 3組大鼠軟骨組織p38 mRNA相對表達量比較模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)的p38 mRNA相對表達量相較于空白組有所增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），火針組膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)p38 mRNA相對表達量與模型組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織p38 mRNA相對表達量比較（± s）

表2 3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織p38 mRNA相對表達量比較（± s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

p38 mRNA 3.83±1.121）6.99±1.06 2.22±0.472）組別空白組模型組火針組鼠數(shù)555

3 討論

3.1 干預方法與選穴依據(jù)KOA臨床癥狀可與中醫(yī)學中有關(guān)“痹證”的描述相對應(yīng)，初起以實證多見，多為風寒濕等外邪阻塞肢體經(jīng)絡(luò)所致［12］，治法以祛風散寒除濕、疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀為主，兼以培補肝腎、扶助正氣。火針針身經(jīng)火焰燒灼后迅速刺入患處，帶火熱之性直達病灶，具有溫陽補虛、溫經(jīng)散寒的功效，與普通針刺或溫針灸相比，刺激量更大，疏通氣血的效用更為強勁，又無灸法帶來的艾煙困擾，且點刺操作疾進疾出、無需留針、簡便效廉，亦方便了患者。“腧穴所在，主治所在”，復雜網(wǎng)絡(luò)分析［13］表明針灸治療KOA以下肢局部取穴為主，內(nèi)膝眼與犢鼻穴位于髕韌帶兩側(cè)凹陷處，使用頻率在臨床治療KOA 的腧穴中排名前二；古籍中亦有內(nèi)膝眼、犢鼻穴直接治療膝痛的記載，如《玉龍歌》“膝頭紅腫不能行，必針膝眼膝關(guān)穴”，《靈樞·本輸》曰：“刺犢鼻者，屈不能伸”，可見內(nèi)膝眼、犢鼻穴能有效發(fā)揮近治作用，緩解膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、屈伸不利等癥狀。

3.2 火針對TNF-α與p38 mRNA的影響TNF-α是一種多效性細胞因子，具有很強的促炎和免疫調(diào)節(jié)特性，在眾多急慢性炎癥性疾病中起關(guān)鍵作用［14］，被視為骨性關(guān)節(jié)炎的起始因子。劉軍等［15］采用TNF-α 干預建立大鼠KOA 模型，與手術(shù)建模組進行對比，4 周后發(fā)現(xiàn)TNF-α對軟骨細胞的影響與手術(shù)造模組相似，TNF-α 同樣可促使炎癥因子指標、軟骨細胞凋亡率增高；Ozler 等［16］比較了2 個不同階段的KOA 患者血清和滑液中基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）和TNF-α的水平，研究表明與KOA 3級的患者相比，KOA 4級的患者血清TNF-α表達進一步增加，TNF-α 水平系統(tǒng)性升高與骨關(guān)節(jié)炎分級嚴重程度一致。而現(xiàn)代研究［17，18］證實TNF-α與p38 MAPK通路有所關(guān)聯(lián)。MAPK通路包括MAPK激酶的激酶、MAPK激酶和MAPK，呈三級激酶模式，受外界刺激信號影響，激酶逐級激活，共同調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多個生理過程［19］，在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中可能處于樞紐位置，與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的合成，關(guān)節(jié)軟骨炎性因子的產(chǎn)生，軟骨細胞表型的保持、分化及軟骨細胞的凋亡等有緊密聯(lián)系［20］。而一些干預方法確實可以通過抑制p38的表達阻斷p38 MAPK信號通路的異常激活，減輕KOA的炎癥反應(yīng)、減少軟骨細胞凋亡、減緩軟骨退行性改變進程［21］。

本實驗結(jié)果表明運用木瓜蛋白酶法建立KOA 模型后，大鼠血清TNF-α 含量與膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)p38 mRNA 的表達均上升明顯，提示KOA 發(fā)生后，p38 MAPK 信號通路被激活，促使炎性因子分泌，推動KOA病程發(fā)展；但經(jīng)過火針點刺內(nèi)膝眼、犢鼻穴的KOA 模型大鼠血清TNF-α 及膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)p38 mRNA 表達均下調(diào)，說明火針能夠有效降低外周血內(nèi)TNF-α 水平及軟骨組織內(nèi)p38的基因表達。

綜上，減少免疫炎性因子含量、抑制p38 MAPK 信號通路活化可能是火針改善KOA臨床癥狀的機制之一。