SDE-GC-MS結合OPLS-DA分析不同生態區谷子品種香氣特征

李少輝，趙巍，劉松雁，李朋亮，張愛霞，劉敬科

SDE-GC-MS結合OPLS-DA分析不同生態區谷子品種香氣特征

1河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所，石家莊 050051；2石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心，石家莊 050041

【背景】我國谷子產地分為4個地區，包括東北平原地區、華北平原地區、內蒙古高原地區和西北地區，谷子區域試驗旨在篩選具有良好遺傳性狀的種質資源。但是，良好的生長遺傳性狀和米粒外觀表型未必具有良好的烹飪品質和香氣特征，特別是香氣特征在很大程度上影響了其生產和下游產業。蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）是一種預處理手段，可模擬煮粥的過程，適合于谷子的香氣分析。【目的】明確不同生態區谷子種質資源香氣特征，推動感官導向型育種-加工產業實踐。【方法】采用同時蒸餾萃取-氣相色譜-質譜聯用法（simultaneous distillation extraction-gas chromatography-mass spectrometry,SDE-GC-MS）結合香氣活性值法（odor activity value，OAV），分析我國華北、東北、西北和內蒙古4個生態區谷物香氣成分差異。【結果】SDE-GC-MS分析結果表明4個生態區12個谷子品種共檢測出81種揮發性物質，包括醛類25種，醇類6種，酚類4種，酮類11種，碳氫11種，含苯衍生物13種，酸類4種，其他7種。對比檢測結果發現，不同地區中揮發性物質的種類基本相似，但各成分相對含量有所不同。對37種揮發性成分特征進行了香氣描述，并結合香氣活性值確定了12個谷子品種有23個OAV>1的有貢獻的香氣化合物。通過正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）建立谷子區試的有效判別模型，將12個谷子品種劃分為3類，篩選出18種VIP（variable importance in projection）大于1的化合物：2,4-癸二烯醛、()-3,5-辛二烯-2-酮、2-(2-丙烯基)-呋喃、己醛、2-戊基呋喃、2-乙酰基噻唑、庚醛、()-2,4-癸二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮、苯甲醛、十四酸、2-戊基呋喃、()-2-庚烯醛、庚醇、2-甲氧基-苯酚、乙基苯、十六酸甲酯，可用于區分不同樣品之間的差異。【結論】SDE-GC-MS結合OAV鑒定分析了我國不同生態區谷子風味成分及關鍵香氣特征化合物，OPLS-DA模型篩選了區分不同樣品及生態區谷子風味差異的18種VIP化合物，研究結果為了解我國不同地區種植谷子風味特征的差異，以及以此為基礎開展風味導向型谷子品種選育與種植加工提供了數據參考。

同時蒸餾萃取；谷子；香氣活性值；生態區；正交偏最小二乘判別

0 引言

【研究意義】谷子（L. Beauv）為我國特色農作物，食用部分稱小米，營養豐富[1]。我國谷子產地分為東北平原區、華北平原區、內蒙古高原區和西北地區4個地區。但谷子屬于光敏作物，種質資源地理來源差異會對谷子造成異地不能抽穗、不成熟等現象，極大影響了谷子的生產與產業發展。鑒于谷子的生長特性，在區域試驗時將谷子異地種植，以觀察篩選遺傳性狀好的種質資源，篩選食用風味品質更好的品種。【前人研究進展】良好的生長遺傳性狀及小米外觀表型未必有好的蒸煮品質和香氣特征，尤其是香氣特征，它是人們判斷小米是否被接受及喜愛的關鍵點之一[2]。目前，食品中香氣風味特征的鑒定手段主要有同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）[3]、固相微萃取[4]（solid-phase microextraction，SPME）、溶劑輔助蒸發萃取[5]（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）等前處理手段，提取風味物質，再通過氣質聯用技術或氣質嗅聞進行鑒定，應用范圍包括駝奶、魚糜制品、蘑菇、薯片[6-9]等多種食品，并取得了良好的檢測效果。SDE是樣品與一定比例的溶劑在密閉燒瓶內持續沸騰，并通過另一端收集餾分的前處理手段，這一過程類似煮粥過程，且試驗系統密閉，樣品香氣流失較少，適合對谷子樣品進行分析。劉瑩瑩[10]采用SDE法結合GC-MS對不同產地谷子多種揮發性成分風味進行了鑒定，并將其分為醛、酚、酸、含苯衍生物、醇、酮、碳氫化合物和雜環化合物等8類。李明哲等[11]對不同顏色的谷子揮發性成分做了比較，并鑒定出了己醛、壬醛、（）-2,4-癸二烯醛和2-戊基呋喃等差異成分，指出這些可能是造成它們香氣不同的原因。【本研究切入點】目前缺少我國不同生態產區谷子育種適應性風味特征的系統研究。【擬解決的關鍵問題】本研究根據樣品的特性，選用同時蒸餾萃取模擬煮粥過程以更好地進行谷子風味萃取，在4個區試地區中各選3個品種共12個品種的谷子進行氣相色譜風味成分檢測，并通過氣味活性值法（OAV）鑒定香氣特征，利用判別產品產地的經典方法—正交偏最小二乘法判別分析對區試品種進行分類建模，為豐富我國谷子種質資源信息，探明谷子風味特征，推動我國以風味導向型育種生產為基礎的谷子產業發展提供理論數據。

1 材料與方法

試驗于2022年在河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所和石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心實驗室進行。

1.1 材料與試劑

由河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所通過國家谷子高粱產業體系平臺提供12個谷子區試品種，從4個區中每個區選取3個優良品種，試驗前置于-20℃備用，試驗于2022年3—6月進行。NaCl，國藥集團化學試劑有限公司；C7—C30烷烴標樣，美國Sigma公司；乙醚（色譜純），美國Honeywell公司；無水Na2SO4，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SY2001-NSART100碾米機：韓國雙龍機械產業株式會社，SY88-TH礱谷機：韓國雙龍機械產業株式會社；IKA MF10粉碎機：德國IKA集團，電子調溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司，恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司，HP-5016GD氮吹儀：上海濟成分析儀器有限公司；同時蒸餾萃取裝置：南京鑾玉化玻儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 同時蒸餾萃取（SDE） 同時蒸餾萃取方法參考劉瑩瑩[10]，略有調整。將150 g脫殼谷子和3 000 mL重蒸水加入5 000 mL的圓底燒瓶中，連接到SDE的右端置于電熱套使溶液沸騰，在左端燒瓶中加入50 mL重蒸乙醚，水浴使乙醚也處于沸騰狀態。將2 h內提取的乙醚置于冰箱冷凍過夜，加入無水硫酸鈉除水相后氮氣吹掃至1 mL，從中取1 μL進行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS條件 檢測方法參考LI等[12]，略有調整。GC檢測條件：色譜柱為DB-5ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃。程序升溫設置：起始溫度45 ℃保留2 min，以2.5 ℃?min-1的速率升溫至65 ℃，并且保留2 min，然后再以5 ℃?min-1升溫到220 ℃，溫度保留3 min。載氣為氦氣（He），流速1.0 mL?min-1，不分流。

質譜檢測條件：電離方式為EI，燈絲發射電流為200 μA，電子能量70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，掃描質量范圍33—450 amu。

1.3.3 數據處理 定性分析：通過NIST05譜庫的檢索保留正反匹配度在800（最大1 000）以上的物質，所得結果參考化合物保留指數的文獻報道（retention index literature，RIL），對化合物進行定性分析。

定量分析：采用內標法對醋的香氣成分進行定量，內標3-辛醇，加入量為50 mg?L-1。化合物濃度=（化合物峰面積/內標峰面積）×內標濃度。

OAV=風味成分的濃度/此成分的閾值。

1.4 數據處理

每個樣品重復檢測3次，最終結果用平均值±標準差表示。采用SIMCA 13軟件進行OPLS-DA分析，采用Origin 2018軟件進行雷達圖和熱圖繪制，熱圖由物質含量數據經過歸一化后生成。

2 結果

2.1 4個生態區谷子揮發性風味整體情況

通過SDE-GC-MS技術分析4個生態區12個谷子樣品揮發性風味組分，結果見圖1。12個谷子樣品共檢測到81種，其中醛類25種，醇類10種，酮類11種，碳氫11種，含苯衍生物13種，酸類4種，雜環及其他7種，含量較高的揮發性風味成分有己醛、庚醛、苯甲醛、壬醛、2,4-癸二烯醛、4-乙烯基愈創木酚、2,4-二(1,1-二甲基)苯酚、法尼基丙酮、十五酸、十六酸、2-戊基呋喃。其中西北地區朝谷58、太選15、承11-727三個品種分別檢測到51、46、55種，內蒙古地區1k196、1322-5、1323-20分別檢測到60、47、53種，華北地區冀谷19、鄭10-1、濟0621-6分別檢測47、52、49種，東北地區九谷、龍11-58070、雙2008-5三個品種分別檢測到43、41、46種。總含量最高的是太選15，含量達12 539.9 μg?kg-1，其次是龍11-58070（9010.13 μg?kg-1）和雙2008-5（7 586.6 μg?kg-1）。揮發性種類最多的是1k196，達到60種。

2.2 谷子揮發性成分分類結果

醛類是谷子中含量和種類均最多的一類物質[13]，也是最重要的一類物質，這與前人對谷子揮發性成分的研究結果相似。在醛類化合物中，庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛未在冀谷19、鄭10-1、九谷、龍11-58070、雙2008-5中檢測到，太選、濟0621-6、龍11-58070的10個碳以上的長鏈醛類含量較少。總體來看，華北、東北兩地區種植品種醛類物質較少，可能與氣候和生長周期有關。

圖1 不同地區谷子風味化合物含量熱圖

本研究檢測發現6種醇類。醇類是谷子的重要揮發性成分，它們一般具有果香、花香和青草香[14]，除3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇外，絕大多數樣品醇含量較低，一般在100 μg?kg-1以下。1-己醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇存在于大多數谷子樣品中，而苯乙醇僅在朝谷58中被檢測到，含量僅為7.52 μg?kg-1。

共檢測到4種酚類化合物，分別為2-甲氧基-苯酚、4-乙烯基愈創木酚、2,4-二(1,1-二甲基)苯酚和2,5-二(1,1-二甲基)苯酚。2,5-二(1,1-二甲基)苯酚在大多數的樣品中均被檢測到，4-乙烯基愈創木酚僅在冀谷19和濟0621-6中檢測到。由于它們含有苯環，一般將其列為含苯衍生物類，但考慮到其生物活性[15]，將其單獨列出來分析。

共檢測發現11種酮類。酮一般在谷物中呈皂香味和果香味，樣品中各類酮的濃度保持在5.3—240.09 μg?kg-1。谷物常見的酮類2-庚酮、()-3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮和香葉基丙酮在各品種小米含量最普遍，均被檢測到。

另外，還檢測到11種碳氫化合物、13種苯衍生物、4種酸、4種雜環類和1種酯類，這些物質和以上種類的物質共同構成谷子中揮發性成分。

2.3 谷子特征香氣化合物及OAV分析結果

雷達圖將12種谷子中有氣味描述的37種化合物按照醛類、醇類、酮類、苯衍生物、其他共分為5類，分別在雙2008-5、冀谷19、朝谷58、1k196、1322-5這幾個品種中有較大香氣貢獻（圖2）。

為了評價各物質的貢獻，引入香氣活度值（OAV）[16]，通過計算OAV得出區試谷子香氣特征組分，表1為其香氣閾值、風味描述和OAVs。12個谷子品種共有香氣特征化合物37種。其中OAV>1的化合物有23種，己醛、庚醛、辛醛、苯乙醛、()-2-辛烯醛、壬醛、2-壬烯醛、癸醛、萘、(,)-2, 4-壬二烯醛、(,)-2, 4-癸二烯醛、2-戊基呋喃在所有谷子品種中均大于1，其余15種化合物部分OAV>1。各品種OAV>1的化合物數量有所不同，其中醛類最多，為9—14種，醇、酚類、酮類、苯的衍生物、其他化合物一般1—2種。而OAV<1，則對谷子的香氣貢獻不明顯。

圖2 不同區試谷子品種風味雷達圖

2.4 不同區試谷子品種風味特征OPLS-DA

為了分析4組谷子樣品之間的差異，基于相關性分析結果，對所得數據進行正交偏最小二乘分析以有效地說明樣品之間的差異。該模型的R2X、R2Y和Q2得分分別為98.2%、100%和56.3%，提取的兩個主成分可解釋98.2%，表明OPLS-DA模型的數據擬合良好。考慮到監督分類模型容易出現過擬合，進行了200次排列檢驗來驗證其準確性。如圖3-A所示，得到的OPLS-DA得分圖顯示了3個不同的聚類，華北地區的鄭10-16、濟0621-6、冀谷19，西北地區的承11-727、太選15和朝谷58等6個谷子品種位于第一象限；內蒙古地區的1322-5、lk196和1323-20三個品種位于第二、三象限交界的X負半軸；東北地區的龍11-58070、九谷、雙2008-5位于第四象限。由載荷圖可知，2,4-癸二烯醛、十六酸等在第一主成分的載荷較大，己醛、庚醛、4-乙烯基愈創木酚、()-9,12-十八二烯酸等在第二主成分的載荷較大（圖3-B）。

表1 不同生態區地區谷子揮發性氣味化合物香氣活性值

續表1 Continued table 1

“-”表示未檢測到“-” indicate not detected

圖3 不同區試谷子品種風味特征OPLS-DA

通常用VIP來選擇偏OPLS-DA模型中的要素。本模型中18種VIP大于1的化合物可用于區分不同樣品的差異，即2,4-癸二烯醛、(,)-3,5-辛二烯-2-酮、2-(2-丙烯基)-呋喃、己醛、2-戊基呋喃、2-乙酰基噻唑、庚醛、(,)-2,4-癸二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮、苯甲醛、十四酸、2-戊基呋喃、(Z)-2-庚烯醛、庚醇、2-甲氧基-苯酚、乙基苯、十六酸甲酯（圖3-C）。

3 討論

3.1 谷子香氣化合物成分分析

醛類一般具有青草、脂肪、橄欖等香氣，在谷物中普遍存在，其中己醛、壬醛，在燕麥、大麥、大米[18-19]等谷物中被證實為較高含量的揮發性成分，但長期儲存時，這些物質會對谷物風味產生負面影響。醛通常來自谷物中存在的不飽和脂肪酸的碳-碳雙鍵的自動氧化和酶解氧化[20]。高溫蒸煮過程中，脂類降解會有大量的醛類物質產生[21-22]，報道稱谷子的脂肪酸組成包括亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生四烯酸等[12]，它們在小米煮粥過程中會降解，()-2-癸烯醛和C7—C9烷烴類主要是油酸氧化的產物，(,)-2,4-壬二烯醛和2-烯醛主要衍生自亞油酸。Bi等[23]也把煮粥引起的()-2,4-庚二烯醛、(,)-2,4-壬二烯醛、()-2-癸烯醛和()-2,4-癸二烯醛4種二烯醛含量的增加歸因于亞麻酸的降解，它們為小米粥帶來了脂肪和堅果味。研究表明較高溫度儲存小米會產生己醛、()-2-壬烯醛和辛醛等脂肪酸氧化的產物，它們對小米保存不利。小米中的醇類通常通過脂肪酸的仲氫過氧化物的分解形成，例如1-辛醇主要通過油酸的氧化產生，1-辛烯-3-醇和1-己醇主要來源于亞油酸的分解。

酚類化合物也是谷子中一類重要的香氣活性化合物，主要在米糠中存在。其中愈創木酚類化合物有煙熏味，在發酵谷物制品[24]、郫縣豆瓣醬、日本味噌和朝鮮大醬[25-26]中有2,6-二甲氧基苯酚、4-乙烯基愈創木酚、4-甲基愈創木酚等酚類的報道，并且被鑒定為關鍵香氣化合物。證實了大部分酚類化合物是由阿魏酸熱降解或谷物發酵時酵母代謝產生的[27-28]。

酮類的香氣一般為青草香、果香。然而，由于酮類的高氣味閾值，這些化合物對谷子的香氣貢獻較小。已有研究表明不飽和脂肪酸的自動氧化可以形成酮[17]，例如油酸氧化可產生2-庚酮。脂類的氧化會對谷物的生理生化代謝產生不良影響，降低儲藏谷物的質量[20]。

碳氫化合物和苯衍生物在谷子中較為常見，其中碳氫類一般閾值較高，一般為10—18個碳原子的烷烴或烯烴。烷烴被認為是植物的內源性物質，起源于長鏈脂肪酸的脫羧[29]。碳氫類化合物具有較高的閾值，對谷子的氣味起平衡作用。而含量相對較低的含苯衍生物可能會對谷物的香氣產生貢獻，但大多數是負面的，如芴、菲等物質，推斷可能是環境污染所致，谷物中很少有此類物質生成。

十四酸、(,)-9,12-十八二烯酸、十五酸、十六酸4種酸類均為長鏈，分析應該是高溫蒸煮所致。另外還有呋喃類、噻唑類等雜環類和一種酯類被檢測到，包括呋喃、2-(2-丙烯基)-呋喃、2,3-二氫苯并呋喃和2-戊基呋喃等，其中2-戊基呋喃具有甘草和豆類的香氣，是亞油酸的次級氧化產物[30]。不同谷子化合物種類和含量的一些差異可歸因于品種、生長條件、收獲后儲存條件和所采用試驗方法的差異。

3.2 香氣活性值及差異化合物篩選分析

雖然每個區試谷子品種檢測到了幾十種揮發性物質，但不是所有物質都對谷子的香氣特征有貢獻，OAV值分析可鑒定風味物質對香氣的貢獻。醛類在谷子的風味中起著重要作用，以(,)-2,4-癸二烯醛為例，它在東北區和華北區的OAV值相差較大，具體到品種九谷和冀谷19，兩個品種的OAV分別為586.57和6 307.57，兩者相差十倍；庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛在東北區和華北區的OAV值都為0，明顯不同于西北區和內蒙古區以上化合物有OAV貢獻的情況。雷達圖也表明這些化合物之間的含量和風味貢獻差異可能就是品種間口味不同的原因之一。

值得注意的是，VIP的篩選與OAV的篩選有所區別，VIP的篩選是在OPLS-DA模型下各含量對模型的貢獻值，OAV的篩選是基于各化合物含量及閾值的香氣貢獻，篩選結果會有部分重合。因此，基于VIP值，結合單向多變量分析特征風味化合物可更有效地篩選差異化合物[30]。

4 結論

4個生態區12個品種谷子共鑒定出81種芳香活性化合物，其中醛類25種，醇類6種，酚類4種，酮類11種，碳氫類11種，含苯衍生物13種，酸類4種，其他7種，OAV>1的有23種。4個生態區各谷子品種在風味化合物數量、含量以及特征香氣貢獻上均有不同。OPLS-DA篩選出VIP關鍵化合物18種，包括己醛、庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛、(,)-2,4-癸二烯醛、2,4-癸二烯醛、壬烷、十四烷酸、(,)-9,12-十八烷酸、十五烷酸、正十六烷酸、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2,4-雙(1,1-二甲基乙基)-苯酚、2,5-雙(1,1-二甲基乙基)-苯酚、1-庚醇、橙花醇、2-戊基呋喃和十六烷酸甲酯，OPLS-DA模型能夠有效區分不同地區的谷子品種，具有良好的適應性和可預測性。

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Aroma Characteristics of Foxtail Millet Varieties from Different Ecological Regions by Analysis of SDE-GC-MS Combined with OPLS-DA

1Institute of Biotechnology and Food Science, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051;2Shijiazhuang Livestock Products and Veterinary Feed Quality Testing Center, Shijiazhuang 050041

【Background】The foxtail millet production areas in China are divided into four regions: the Northeast China region, the North China region, the Inner Mongolia plateau region, and the Northwest China region. The regional trials aimed to screen germplasm resources with good genetic traits. However, good growth genetic traits and foxtail millet grain appearance phenotypes do not necessarily have good culinary quality and aroma characteristics, especially the aroma characteristics largely affect its production and downstream industries. Simultaneous distillation extraction (SDE) is a pretreatment method that simulates the cooking process of porridge and is suitable for the aroma analysis of foxtail millet.【Objective】The aim of this study was to clarify the aroma characteristics of cereal germplasm resources in different ecological regions, so as to promote sensory-oriented breeding-processing industrial practices.【Method】Simultaneous distillation extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SDE-GC-MS) combined with odor activity value (OAV) method was used to analyze the differences in aroma components of foxtail millet in different regions of China.【Result】 A total of 81 volatile substances were detected in 12 foxtail millet varieties from four ecological regions, 25 aldehydes, 6 alcohols, 4 phenols, 11 ketones, 11 hydrocarbons, 13 benzene-containing derivatives, 4 acids, and 7 others. The comparison of the results showed that the volatile substance subclasses were similar in different regions, but the contents of the components were different. Thirty-seven volatile components with literature-accessible odor characterization were labeled, and 23 contributing aroma compounds with OAV > 1 were identified in the 12 foxtail millet varieties. The effective discrimination model of the cereal regional test was established by orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA). Then, the 12 foxtail millet varieties were classified into three categories, and 18 compounds with VIP>1 were screened out: hexanal, heptanal, ()-2-heptenal, benzaldehyde, ()-2, 4-decadienal, 2,4-decadienal, nonane, tetradecanoic acid, ()-9, 12-octadecadienoic acid, pentadecanoic acid, n-hexadecanoic acid, 2-methoxy-4-vinylphenol, 2, 4-bis(1, 1-dimethylethyl)-phenol, 2, 5-bis(1, 1-dimethylethyl)-phenol, 1-heptanol, nerolidol, 2-pentyl-furan, and hexadecanoic acid methyl ester, which could be used to distinguish the differences between different samples.【Conclusion】 SDE-GC-MS combined with OAV identification analyzed the flavor components and characteristics of key aroma compounds of foxtail millet from different ecological regions, and the OPLS-DA model screened 18 VIP compounds that distinguished the flavor differences of foxtail millet from different samples and ecological regions. The results of the study provided data references for understanding the differences in flavor characteristics of foxtail millet grown in different regions of China, and for a basis of flavor-oriented foxtail millet variety selection, breeding, and processing.

simultaneous distillation extraction; foxtail millet; odor activity value; ecological regions; orthogonal partial least squares discriminant

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.012

2022-10-27；

2023-05-17

國家自然科學基金面上項目（31771902）、財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系資助（CARS-06-14.5-A29）

李少輝，E-mail：lishaohui007@163.com。通信作者劉敬科，E-mail：liujingke79@163.com

（責任編輯 趙伶俐）