H3N2亞型犬流感病毒實驗感染模型的建立

黃程，楊龍峰，孫鵬，程慧敏，楊志遠，林健，祝洪偉，劉立新，孫厚民，李加鳳，趙際成，段會娟，潘潔，劉月煥

H3N2亞型犬流感病毒實驗感染模型的建立

1北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097；2北京市延慶區動物疫病預防控制中心，北京 102100；3青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266113

【目的】建立H3N2亞型犬流感病毒（canine influenza virus, CIV）實驗感染模型，了解犬流感的發病特征，為疫苗效力評價奠定基礎。【方法】6—13月齡CIV血凝抑制（haemagglutination inhibition, HI）抗體陰性（HI＜1﹕10）比格犬26只，其中3只鼻腔噴霧PBS作為陰性對照，另23只分5組（10、103、105、106、107EID50/只），分別為3、5、5、5、5只/組，每只犬各鼻腔噴霧H3N2亞型CIV（A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)，簡稱HB株）病毒液1mL。觀察臨床癥狀、肺臟病變和肺臟組織病理學變化，計算肺實變率，檢測病毒和HI抗體效價。【結果】10 EID50劑量感染組，3只犬均未出現明顯臨床癥狀，肺臟均無明顯眼觀病變，肺臟實變率0%，無組織病理學變化，病毒檢測均為陰性，HI抗體效價幾何平均值（geometric mean titer, GMT）為1﹕15.9；103EID50劑量感染組，5只犬中有4只喘息、流鼻汁和咳嗽，1只犬未表現出臨床癥狀，2只犬肺臟出現輕微實變，實變率平均為1.4%，4只犬病毒分離陽性，HI抗體效價GMT為1﹕320；105EID50劑量感染組，5只犬在攻毒后5 d開始出現流鼻汁和咳嗽等臨床癥狀，肺臟均有實變，實變率平均為4.2%，肺泡間隔增寬，病毒分離均為陽性，HI抗體效價GMT為1﹕2 940.7；106EID50劑量感染組，5只犬在攻毒后4 d體溫升高、流鼻汁、咳嗽，臨床癥狀出現較105EID50劑量感染組早1 d，肺臟實變程度增加，實變率平均為17.9%，肺泡間隔增寬，病毒分離均為陽性，HI抗體效價GMT為1﹕2 228.7；107EID50劑量感染組，5只犬在攻毒后3 d表現出體溫升高、流鼻汁、咳嗽等嚴重的臨床癥狀，癥狀出現較106EID50劑量感染組早1 d，肺臟嚴重實變，實變率平均為29.0%，肺泡間隔增寬，病毒分離均為陽性，HI抗體效價GMT為1﹕2 940.7；對照犬均未出現明顯臨床癥狀，肺臟均無明顯眼觀病變，無組織病理學變化，病毒檢測均為陰性，HI抗體效價均＜1﹕10。【結論】106EID50劑量病毒是能引起犬明顯發病的最小病毒接種劑量，建立起H3N2亞型CIV實驗感染模型。

比格犬；犬流感病毒；H3N2亞型；肺臟；感染模型

0 引言

【研究意義】犬流感（canine influenza，CI）是由正黏病毒科甲型流感病毒屬的犬流感病毒（canine influenza virus，CIV）引起的犬接觸性呼吸道傳染病[1-2]。感染犬表現發熱、精神沉郁、咳嗽和流鼻汁等臨床癥狀，CIV的致病特征是高水平的病毒復制和廣泛的組織損傷[3]。盡管該病致死率不高，但犬只多死于肺部繼發感染[4]，因此本病仍不可被忽視。甲型流感病毒具有跨物種傳播的特性[5-6]。犬作為伴侶動物，給人類和周圍其他動物提供了病毒跨物種傳播的機會，對人類健康構成潛在威脅，具有重要的公共衛生意義[7-8]。此外，CIV造成的呼吸道損傷對警犬嗅覺有一定影響，使得嗅覺減退[9]。【前人研究進展】2004年，在美國佛羅里達州的賽犬中首次暴發H3N8亞型犬流感，研究發現這一亞型起源于馬流感病毒（equine influenza virus, EIV）[5,10]，H3N8亞型犬流感主要在北美洲和歐洲流行[11-12]。2007年韓國首次暴發H3N2亞型犬流感疫情，該亞型最早于2005年從禽類傳播至中國犬類，在犬之間水平傳播[1]。2009—2010年，LI和LIN等[13-14]在浙江、江蘇、北京、遼寧等地也相繼分離到H3N2亞型CIV，且與韓國H3N2亞型CIV高度同源。流行趨勢表明H3N2亞型犬流感已經成為包括中國在內的亞洲地方性動物傳染病[15-16]。不同物種的流感病毒，包括禽流感病毒、人流感病毒等，可與CIV重配[17]，從而促進了犬流感病毒的重組，使流感病毒的致病性、流行性發生改變[18-20]。NA等[21]使用106.75EID50劑量CIV接種7周齡比格犬，觀察到犬出現高熱、流鼻汁的臨床癥狀，犬的肺臟和氣管出現病理變化。Liu等采用不同感染劑量接種10周齡比格犬，可觀察到106EID50接種劑量的犬臨床癥狀明顯，病理變化典型[22]。Wu等對6周齡豚鼠接種106TCID50劑量的CIV，發現CIV可在豚鼠呼吸道復制[23]。【本研究切入點】雖然已有評價H3N2 CIV致病性的相關報道[21-23]，但方法相對復雜，觀察到的臨床癥狀輕，目前尚無系統、可行和易重復的評價方法。鑒于感染用毒株和評價方法不同，有必要建立CIV人工感染模型。【擬解決的關鍵問題】利用分離得到的H3N2亞型CIV（A/canine/China/Huabei-170607/2017（H3N2），簡稱HB株），以1mL/只犬，經鼻腔接種不同病毒含量的H3N2亞型CIV，統計分析臨床癥狀、肺臟實變率、病毒復制和血凝抑制（haemagglutination inhibition, HI）抗體效價，來探究H3N2亞型CIV的致病性和建立犬的發病模型。

1 材料與方法

1.1 毒株

H3N2亞型CIV（HB株，F3代）為北京市農林科學院畜牧獸醫研究所動物疫病研究室分離、鑒定和保存，EID50為107.3/0.1 mL，經純凈性檢驗，無細菌、支原體和外源病毒污染。

1.2 SPF雞胚及實驗動物

（1）SPF雞胚 10日齡SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

（2）犬 26只6—13月齡CIV HI抗體陰性（HI＜1﹕10）比格犬，雌雄各13只，購自青島博隆實驗動物有限公司。

（3）試驗地點 青島易邦生物工程有限公司負壓動物舍，實驗動物使用許可證號SYXK（魯）2016-0016。北京市農林科學院畜牧獸醫研究所。

（4）試驗時間 2019年7月至2021年2月

1.3 試劑

PBS（0.01 mol·L-1，pH7.0—7.2）、胰蛋白胨磷酸鹽肉湯（TPB）、0.5%雞紅細胞和H3亞型CIV HI試驗抗原，均由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所動物疫病研究室制備。

1.4 方法

1.4.1 試驗設計 26只犬隨機分組進行鼻腔噴霧攻毒，在負壓動物舍飼養，自由采食和飲水。試驗分組見表1。

表1 試驗分組

A組為陰性對照 Group A was the non-challenged group

1.4.2 臨床癥狀觀察 每天定時觀察1次，連續監測14 d。觀察精神狀態、采食和糞便等，測定直腸溫度，并填寫臨床癥狀積分表，積分標準見表2。

表2 臨床癥狀評分標準

1.4.3 肺臟病變觀察與實變率計算 攻毒后14 d，試驗犬麻醉后靜脈注射10%氯化鉀致死，剖檢觀察肺臟病變。取實變肺組織，稱重，按照肺臟實變重量/肺臟總重量乘以100%計算肺臟實變率。同時取病變肺臟，10%中性福爾馬林溶液固定，制作石蠟切片，H.E.染色[24]，觀察組織病理學變化。

1.4.4 病毒分離 攻毒后5 d，采集鼻拭子，每份拭子離心后經0.22 μm濾膜過濾，濾液經尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL。置36—37℃孵化至96 h，收獲雞胚尿囊液，測定HA效價。5枚接種雞胚中如有1枚雞胚尿囊液HA效價不低于1﹕16，可判定為病毒分離陽性。

1.4.5 HI抗體測定 攻毒后14 d，采血，離心，分離血清。血清經白陶土和紅血球處理后，測定HI抗體效價[25]，計算HI抗體效價幾何平均值（geometric mean titer, GMT）。

2 結果

2.1 臨床癥狀

體溫結果如圖1。10 EID50攻毒組的犬體溫均未超過39.5℃，在正常體溫范圍內。103EID50攻毒組2只犬在攻毒后6 d體溫高于40℃，超出正常體溫。105EID50攻毒組1只犬在攻毒后11 d體溫高于40℃，超出正常體溫。另外，106EID50和107EID50攻毒組在攻毒后3—6 d體溫與其他劑量攻毒組顯著差異。106EID50攻毒組的5只犬在攻毒后2—6 d體溫陸續高于40℃，超出正常體溫。107EID50攻毒組的5只犬在攻毒后3—6 d體溫陸續高于40℃，超出正常體溫。對照組犬體溫均未高于39.5℃，在正常體溫范圍內。

臨床癥狀評分結果如圖2。10 EID50攻毒組犬均未出現咳嗽等呼吸道癥狀。103EID50攻毒組4只犬在攻毒后2 d開始出現輕微的咳嗽、喘息和流鼻汁，而剩余1只犬未表現臨床癥狀，臨床癥狀積分在第6天最高，達1.6分，后續逐漸恢復，第12天后未見明顯臨床癥狀。105EID50攻毒組的所有犬在攻毒后5 d開始出現流鼻汁、精神沉郁、咳嗽，臨床癥狀積分在第7天最高，達2.6分，后續逐漸恢復，第13天后未見明顯臨床癥狀。106EID50攻毒組所有犬在攻毒后4 d開始出現呼吸系統癥狀，包括流鼻汁、精神沉郁、咳嗽，臨床癥狀積分在第9天出現最高峰，達2.4分，第12天后未見明顯臨床癥狀。107EID50攻毒組5只犬在攻毒后3d開始出現呼吸困難癥狀，臨床癥狀積分在第6天達到最高，即2.4分，第12天后未見明顯臨床癥狀。對照組犬均未出現咳嗽、喘息和流鼻汁等癥狀。

A：陰性對照Non-challenged group；B：10 EID50；C：103 EID50；D：105 EID50；E：106 EID50；F：107 EID50。下同 The same as below

2.2 病理變化

攻毒后14d剖檢，10 EID50攻毒組3只犬肺臟均無明顯眼觀病變，實變率為0%；103EID50攻毒組，2只犬肺臟出現紅褐色硬幣狀大小實變，分別位于尖葉和膈葉，實變率平均為1.4%；105EID50攻毒組，5只犬肺臟均有小面積實變，實變率平均為4.2%；106EID50攻毒組5只犬的肺臟均有紅褐色樹葉狀大小實變，主要位于尖葉和心葉，實變率平均為17.9%，顯著高于105EID50攻毒組；107EID50攻毒組5只犬的肺臟均有嚴重暗灰色大面積片狀實變，主要位于尖葉和心葉，實變率平均為29.0%，實變面積進一步增大；而對照組3只犬肺臟均無明顯眼觀病變（表3和圖3）。

組織病理學變化顯示對照組和10 EID50攻毒組犬肺臟均無病理變化，103—107EID50感染組犬肺臟充血和水腫，肺泡間隔增寬，有明顯的淋巴細胞浸潤（圖4）。

圖2 臨床癥狀評分

表3 肺臟實變率

圖3 試驗犬肺臟大體病變

圖4 試驗犬肺臟組織病理學變化

2.3 病毒分離和HI抗體效價

病毒分離結果見表4。10 EID50攻毒組攻毒后第5天病毒分離均為陰性，103EID50攻毒組4只犬在攻毒后第5天病毒分離陽性，105EID50、106EID50和107EID50攻毒組，所有犬在攻毒后第5天病毒分離均為陽性。

HI抗體效價結果見表4。攻毒后第14天，10 EID50攻毒組犬HI抗體效價GMT為1﹕15.9，但該攻毒組犬未表現出臨床癥狀。103EID50攻毒組犬HI抗體效價GMT為1﹕320。105EID50攻毒組犬HI抗體效價GMT為1﹕2 940.7，顯著高于103EID50攻毒組。106EID50攻毒組犬HI抗體效價GMT為1﹕2 228.7。107EID50攻毒組犬HI抗體效價GMT為1﹕2 940.7。對照組HI抗體效價均小于1﹕10。

表4 病毒分離和HI抗體效價結果

3 討論

犬流感作為一種新發傳染病，近年來在北京等地都有發生，對公共衛生安全具有潛在威脅。目前主要的CIV亞型為H3N8和H3N2，H3N2亞型犬流感在中國廣泛流行[9]。開展H3N2亞型CIV的致病性研究，可為了解該病發病機制、疫苗研究和評價奠定基礎。

3.1 犬人工感染H3N2亞型CIV后的癥狀

流感病毒主要感染上呼吸道及支氣管上皮細胞，但嚴重時可蔓延至細支氣管和肺泡，引起間質性肺炎[26]。本試驗證實H3N2亞型CIV能引起犬的高燒、呼吸急促、咳嗽和嚴重的肺實變，這與SONG、LIU等[1,27]對H3N2 CIV致病性研究結果基本一致。

目前，LUO等[28]參考H3N8 CIV的臨床評分系統研究建立H3N2 CIV臨床癥狀評分。他結合該臨床癥狀評分系統和肺臟病變對H3N2亞型CIV的最小感染劑量進行研究，將臨床癥狀評分和肺臟病變面積作為發病判定標準。但其方法繁瑣。因此本試驗采用肺臟實變率進行肺臟病變評價，探討肺臟實變率是否可作為發病判定標準。本試驗前期研究表明，107EID50劑量攻毒后第7、11、14天，犬肺臟均出現明顯實變，且病變主要分布在尖葉和心葉。攻毒后第7天，肺臟出現紅褐色點狀或片狀實變。攻毒后第11和14天，肺臟出現暗灰色片狀實變，且實變面積大，易于觀察。隨著時間推移，肺臟實變由紅褐色轉變為暗灰色，且病變加重。此外，CIV感染犬的病毒復制情況初步研究表明，105、106、107EID50劑量各感染5只犬，在攻毒后第3—6天所有犬病毒分離均為陽性，第7天分別1只、2只、2只犬病毒分離陽性，第10天病毒分離均為陰性。本試驗中結合前人的研究結果，統計分析臨床癥狀、肺臟大體病變病毒分離、HI抗體檢測等研究結果，采取臨床癥狀觀察、攻毒后第5天病毒分離、攻毒后第14天肺臟實變率3個方面來研究CIV致病性。

3.2 不同病毒含量的H3N2亞型CIV對犬肺臟的影響

本試驗結果表明，10 EID50攻毒組犬未發病，隨著攻毒劑量的增大，犬表現的臨床癥狀越明顯，表明H3N2亞型CIV致病力與病毒含量呈正相關。臨床癥狀一般從感染后第2—5天開始，在第6—7天達到峰值，隨后逐漸減輕。106EID50和107EID50攻毒組臨床癥狀積分分別在第9天和第6天最高。結合前期攻毒后7天HI抗體效價數據，攻毒劑量越大，產生HI抗體越早，HI抗體效價也越高。CIV感染犬后第5天，10 EID50攻毒組病毒分離陰性，103EID50攻毒組4/5犬病毒分離陽性，105EID50、106EID50和107EID50攻毒組所有犬都排毒。犬表現的臨床癥狀與排毒情況也基本一致，10EID50攻毒組犬無明顯異常，103EID50攻毒組4/5犬表現出精神沉郁、咳嗽等臨床癥狀，105EID50、106EID50和107EID50攻毒組所有犬都表現出明顯的犬流感臨床癥狀。肺臟病變結果表明，10EID50攻毒組犬的肺臟部均未出現實變，攻毒劑量越大的組，犬肺臟實變越嚴重。犬在感染107EID50劑量CIV后，雖然臨床癥狀從第7天開始逐漸恢復，直至第14天左右無明顯臨床癥狀，但肺臟實變卻加重。

另外，試驗結果表明，隨著攻毒劑量的增加，犬表現的臨床癥狀越明顯，肺臟病變越嚴重，攻毒劑量與發病嚴重程度呈正相關。105EID50劑量感染犬均能表現出流鼻汁、咳嗽等臨床癥狀，且所有犬肺臟都出現實變，但3/5犬肺臟僅出現輕微實變，4/5犬體溫在正常范圍；106EID50劑量感染犬都能表現出發燒、咳嗽等臨床癥狀，所有犬肺臟出現大面積實變，因此106EID50攻毒劑量可觀察到較明顯臨床癥狀和肺臟實變。另一方面，與LUO等[28]對2014年H3N2 CIV研究中感染犬的肺臟實變面積相比，本試驗感染犬的肺臟實變更明顯，或許與2017年分離的H3N2亞型CIV（HB株）毒力增強有關。

肺臟實變率計算法是基于肺臟病變28分計數法[29]進行簡單化處理，在清楚地看到肺臟病變前提下，稱重方法相對簡單，廣泛應用于評判肺臟發生病變的程度。本研究通過肺臟實變率，發現雖然攻毒劑量越大，實變率越高；但肺臟實變情況與攻毒劑量未見顯著的線性相關關系，推斷CIV感染動物后，劑量達到發病閾值，即可引起發病，肺臟實變面積可能與感染持續時間相關。動物感染流感病毒表現出的肺臟損傷是機體免疫誘導細胞因子所造成的[30]，這種肺臟實變顏色和區域面積隨時間的變化與CIV發病機理及免疫應答是否有關，仍需進一步研究。

通過上述研究，臨床癥狀觀察和體溫檢測具有人為因素的誤差，二者可作為H3N2亞型CIV感染動物試驗的參照。106EID50劑量感染犬出現嚴重的肺臟實變。因此，肺臟的實變程度作為犬發病與否的重要標準。肺臟實變率因人為測定和動物個體差異造成一定的誤差，因此本研究初步將肺臟實變率不小于8%作為攻毒犬發病判定標準。

4 結論

應用H3N2亞型CIV（HB株）人工感染6—13月齡比格犬后，體溫測定、臨床癥狀和肺臟病變觀察、病毒分離和抗體檢測結果表明，106EID50劑量病毒是可感染犬，且能引起犬明顯發病的最小病毒接種劑量。該實驗模型為犬流感發病機制研究和疫苗效力評價奠定了基礎。

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Establishment of a Canine Experimental Infection Model with a H3N2 Subtype Canine Influenza Virus

HUANG Cheng1, YANG LongFeng2, SUN Peng3, CHENG HuiMin1, YANG ZhiYuan1, LIN Jian1, ZHU HongWei3, LIU LiXin1, SUN HouMin3, LI JiaFeng3, ZHAO JiCheng1, DUAN HuiJuan1, PAN Jie1, LIU YueHuan1

1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097;2Yanqing District Animal Disease Prevention and Control Center of Beijing Municipality, Beijing 102100;3YEBIO Bioengineering Co., Ltd of Qingdao, Qingdao 266113, Shandong

【Objective】In this research, an experimental animal infection model of canine influenza virus (CIV, H3N2 subtype) was established to better understand the pathogenesis of canine influenza, so as to lay the foundation for vaccine efficacy evaluation. 【Method】26 beagles aged 6-13 months with negative CIV Haemagglutination Inhibition (HI) antibody (HI＜1﹕10) were selected, three beagles of whichwere challenged by 1mL nasal spray of PBS, and 23 beagles of which were challenged by1mL nasal spray of H3N2 CIV (A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2),HB strain for short) with 5 groups (10, 103, 105, 106, and 10750% EID50) as 3, 5, 5, 5, and 5 beagles each group, respectively.Clinical symptoms, lung lesions, histopathological changes of lung, calculating the proportion of consolidation mass, HI antibody titer and virus shedding were examined at 14 days after virus challenge together with three control beagles. 【Result】 3 beagles inoculated with a dose of 10 EID50H3N2 CIV did not show any clinical symptoms, gross lesions in lungs and histopathological changes, the consolidation rate was 0%, and the virus shedding was not detected. The geometric mean titer (GMT) of HI antibodies was 1﹕15.9. However, 4/5 of beagles inoculated with a dose of 103EID50H3N2 CIV showed the clinical symptoms and virus shedding, such as puffing, runny nose and cough. 2/5 of beagles showed light lung consolidation, whose rate was 1.4%. The GMT of HI antibodies was 1:320. All beagles (5/5) infected with a dose of 105EID50H3N2 CIV showed clinical symptoms at day 5 after challenge, such as runny nose and cough, virus shedding, lung consolidation, and widened alveolar septum, and the consolidation rate was 4.2%. The GMT of HI antibodies was 1﹕2 940.7. 5/5 of beagles infected with a dose of 106EID50all showed severe clinical symptoms at day 4 after challenge, such as cough and elevated body temperature, virus shedding, obvious pathological features in the lungs, and the GMT of HI antibodies was 1﹕2 228.7. The clinical symptoms appeared earlier 1 day than that in 105EID50dose infection group, and the degree of lung consolidation increased. The lung consolidation ratio was 17.9%. 5/5 of beagles infected with doses of 107EID50all showed severe clinical symptoms at day 3 after challenge which appeared earlier 1 day than that in 106EID50dose infection group, virus shedding and widened alveolar septum in the lungs, the GMT of HI antibodies was 1﹕2 940.7, and the consolidation rate of lung was 29.0%. The control beagles did not show any clinical symptoms, gross lesions and histopathological changes in lungs, the virus shedding was not detected, and GMT of HI antibodies was ＜1﹕10. 【Conclusion】The dose of 106EID50was the minimum virus inoculation dose that could cause obvious pathogenesis in beagles. An experimental animal infection model of CIV subtype H3N2 in beagles was established.

beagles; canine influenza virus; H3N2 subtype; lung; infection model

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.015

2022-03-28；

2022-08-02

北京市農林科學院科技創新能力建設專項（KJCX20200211）、北京市農林科學院畜牧獸醫研究所事業基金（XMSSYJJ202110）、北京市農林科學院青年基金（QNJJ202025）

黃程，E-mail：huangc_2019@163.com。通信作者劉月煥，E-mail：liuyuehuan@sina.com

（責任編輯 林鑒非）