不同配方高脂飼料誘導建立大鼠高脂血癥模型的比較研究*

亓 妙 徐晨曦 呂玲娟 楊志宏 楊潤梅

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193)

高脂血癥是一種以機體血液脂質水平異常為特征的常見代謝性疾病,也是引起動脈粥樣硬化、心腦血管疾病及脂肪肝等的重要致病因素。它對人體的損害是隱蔽、逐步、進行性的,是一種全身性的疾病。隨著人們飲食結構的改變,高脂血癥的發病率明顯上升,成為了目前常見臨床疾病[1],而且由其誘發的各類疾病已嚴重威脅人類身體健康。建立穩定、理想的高脂血癥模型是研究疾病的重要基礎,也是降脂新藥研發的需要。

大鼠是目前最常用的實驗動物,具備飼養方便、成本較低、取血量大等特點,也常用于建立高脂血癥動物模型,廣泛的用于降脂藥物的研究[2-3]。通過文獻[4-6]調研,我們發現大鼠的高脂飼料配方種類眾多,建模效果也不穩定。因此本實驗在飼料中添加不同比例的膽固醇、豬油、蔗糖、果糖和酪蛋白等常用造模劑,目的在于找到一個能誘導穩定高脂血癥模型的大鼠高脂飼料配方,為降脂藥物的研發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級雄性SD大鼠60只,體質量200～220 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】。飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所動物中心屏障環境【SYXK(京)2017-0020】中。溫度:21～25 ℃,濕度:40%～60%,12 h光照陰暗交替。所有實驗操作均按照該中心的操作指南執行,并得到中國醫學科學院藥用植物研究所動物倫理委員會的許可,倫理審批號:SLXD-20200918027。

1.1.2實驗飼料:普通飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供,高脂飼料從河南省環宇禾康生物科技有限公司自行訂購,總共有五種配方。配方見表1。

表1 高脂飼料配方表(%)

1.1.3試劑:血清總膽固醇(total cholesterol, TC)檢測試劑盒,批號191671,有效期至2021-06-23;甘油三酯(triglyceride, TG)檢測試劑盒,批號191051,有效期至2021-08-26;低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)檢測試劑盒,批號191321,有效期至2020-09-26;高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)檢測試劑盒,批號191211,有效期至2020-10-13,以上試劑盒均來源于中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 方法

大鼠適應飼養3 d后開始實驗,隨機分為正常組、模型1組、模型2組、模型3組、模型4組、模型5組,10只/組。正常組給予普通飼料,其余各模型組給予相應配方的高脂飼料,配方見表1。自由飲水,連續喂養6周。每日記錄大鼠進食量,每周稱重。分別于造模1、2、4及6周后,禁食不禁水12 h,大鼠麻醉后眼眶內眥后靜脈叢采血約0.5 mL,血樣4 ℃下靜置2 h、3 500 r/min離心15 min取血清,測定TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。過量麻醉處死大鼠,剖取肝,檢測肝中TG、TC的含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 進食量

與正常對照組大鼠相比,模型2組、模型3組和模型5組大鼠的進食量明顯減少,其中,模型2組從造模第1周持續至第6周,差異具有統計學意義,模型3組大鼠在造模第1、3、4、5和6周差異具有統計學意義,模型5組大鼠在造模第3、4和6周差異具有統計學意義。其余模型組大鼠進食量與正常組比較無明顯差異(表2)。

表2 各組大鼠進食量

2.2 體質量

造模前各組大鼠體質量無明顯差異。與正常組大鼠相比,造模1周后開始,持續至6周,模型3組大鼠體質量明顯降低,差異有統計學意義;其余各模型組大鼠體質量與正常組大鼠比較無明顯差異(圖1)。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 血清脂質含量

與正常組大鼠相比,造模1周后至6周,各模型組大鼠的總膽固醇(TC)含量,與正常組相比都有所升高,但只有模型2和模型3組大鼠與正常組的差異一直有統計學意義(圖2);造模1周后持續至6周,各模型組大鼠血清中的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量與正常組相比均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.001)(圖3);各模型組大鼠血清中的高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)含量與正常組相比均有所降低,其中模型4組和5組從造模1周后持續至6周,差異均有統計學意義(圖4);與正常組相比,造模1周后持續至4周,模型1、2、3組和5組大鼠血清甘油三酯(TG)含量均明顯降低,差異有統計學意義(圖5)。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 肝指標

與正常組大鼠相比,各模型組大鼠肝中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量明顯升高(圖6),肝重系數明顯增大(圖7),差異均有統計學意義。同時在解剖過程中可以觀察到,正常組大鼠肝呈表面暗紅,邊緣光滑銳利且彈性好,而各模型組大鼠的肝與正常組大鼠相比,均呈淡黃色,無光澤,體積均勻性增大,肝質地較硬,邊緣鈍圓,彈性變差。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.01,**P<0.001

3 討論

機體內膽固醇的來源主要有兩條途徑,一是內源性的生物合成,二是外源性的飲食攝入[7]。根據參考文獻[8-9]可知,由于膽固醇結構的特點其無法在細胞內被分解,過量攝入容易造成機體內膽固醇代謝紊亂,最終導致非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動脈粥樣硬化等。在飼料中添加膽固醇增加了大鼠的外源性膽固醇的攝入,能夠導致其在細胞內或是血管內累積,從而形成高膽固醇血癥和脂肪肝。豬油是一種動物脂肪,主要由飽和脂肪酸甘油酯與不飽和脂肪酸甘油脂組成。膽鹽是膽汁酸分別與鈉或鉀結合形成的鹽類,有著能使脂肪變成細小的脂肪微滴的生理功能,大大增加了脂肪與酶的接觸面積,促進了脂肪的分解與吸收[10],因此在高脂飼料中添加膽鹽,來促進大鼠對脂肪的消化和吸收。與正常組相比,模型2和3組的血清總膽固醇含量在造模1至6周持續保持升高,且差異有統計學意義,而其他組別的血清中總膽固醇的含量在造模2周達到峰值后,造模4周和6周后與正常組比較均無明顯升高。比較各高脂飼料的配方可發現,各配方中膽固醇的添加量都是1%,表明膽固醇不是造成各模型組大鼠血清總膽固醇含量有差異的原因。配方2和3高脂飼料跟其他配方高脂飼料的共同差異在于添加了20%果糖和10%豬油,由此我們分析造成模型2和3組大鼠血清總膽固醇含量明顯升高的原因是在添加1%膽固醇和0.3%膽鹽基礎上,20%果糖和10%豬油共同發揮了作用。

根據參考文獻[11]的研究發現,補充果糖的大鼠會出現高甘油三酯血癥,骨骼肌和內臟白色脂肪組織中的VLDL受體和脂蛋白脂肪酶表達降低。有研究[12]發現喂食高蔗糖(68%)和高果糖(60%)飲食的Wistar大鼠在3周和8周后TG水平分別增加了4倍。上述文獻表明,飲食中添加果糖和蔗糖都能夠成功建立大鼠高甘油三酯血癥模型,所以本實驗我們在不同組別中分別添加了果糖和蔗糖來進行誘導造模。但實驗結果發現各模型組大鼠血清中TG含量一直沒有升高,反而呈下降趨勢,與文獻報道并不一致。推測可能是因為高脂飼料誘導,外源性脂肪和膽固醇的大量攝入,對大鼠內源性甘油三酯合成形成了抑制,或同時抑制了甘油三酯從肝向血液的釋放[13]。且大鼠血漿TG清除率較高,不易建立穩定的高TG模型[14]。

同時,此次實驗中,模型2組“20%果糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+5%酪蛋白+63.7%基礎飼料”、模型3組“20%果糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+68.7%基礎飼料”和模型5組“20%蔗糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+5%酪蛋白+68.7%基礎飼料”的大鼠進食量低于正常組大鼠且具有統計學意義,可能是這三個配方飼料中都添加了10%豬油,飼料口感油膩,導致適口性下降,大鼠進食量減少。

各模型組中只有模型3組大鼠體質量與正常組大鼠比較有明顯下降,可能是因為配方3高脂飼料中未添加酪蛋白,而酪蛋白是動物乳汁中含量最高的蛋白質,可為機體提供生命活動和生長所需要的必需氨基酸。有研究[15]表明,酪蛋白對于大鼠的生長有一定的促進作用,所以我們推測由于模型3組大鼠未添加酪蛋白,大鼠攝入的蛋白質較低,可能影響到大鼠身體發育生長,從而導致配方3組體質量增長率低。

綜上所述,本次實驗發現,與正常對照組大鼠相比,通過單純的高脂飼料誘導,造模6周后,模型2和模型3組大鼠血清中總膽固醇(TC)含量顯著升高,各模型組大鼠血清中的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量均顯著升高;且與正常組大鼠相比,各模型組大鼠肝中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量也顯著增加,表明配方2和配方3高脂飼料能夠成功建立穩定的大鼠高膽固醇血癥模型。本研究為降脂藥物篩選和評價提供了一種操作簡便、低成本、穩定的動物模型,特別是針對治療高膽固醇血癥的藥物。