實驗動物質量保障體系和服務體系建設

張 靜 劉苗苗 唐倩倩 尹玉濤 陳 楨 謝忠忱 常 在

(1.清華大學生命科學學院,北京 100084)(2.清華大學實驗動物中心,北京 100084)

實驗動物設施作為生命科學研究不可或缺的支撐條件,其平臺建設和技術服務水平直接影響著相關學科的發展,是實現科技進步,提高我國國際地位的重要基礎。清華大學實驗動物中心是清華大學“十一五”期間重點建設的校級平臺,擁有一期和二期兩個實驗動物設施,總建筑面積合計7 800 m2,可容納4萬余籠小鼠,少量大鼠、兔、豚鼠、雪貂的飼養和實驗。為了給生命相關學科的研究提供優質的實驗動物資源和一流的技術服務,我們的工作重心在于建立并維護良好的實驗動物保障體系,提升專業技術服務能力,力求對標國際一流水準,為國內實驗動物行業發展提供新思路。

1 實驗動物質量保障體系的建立

1.1 實驗動物福利倫理審查委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的建立及其作用

清華大學IACUC自2010年成立,核心成員包括10名教授、1名主治獸醫、1名非生物醫學相關研究背景機構成員、1名公眾代表(非機構內成員)以及兩名秘書。IACUC會議按照團隊工作方式定期召開,通過對實驗動物的使用計劃、操作程序和設施運行進行討論,形成統一的決議和倫理審查報告,以保證實驗動物設施在運行實踐中符合相關的法律和法規要求。IACUC具體工作包括:

1.1.1實驗動物從業人員資格審查及培訓:根據中華人民共和國和北京市有關法律、法規,《清華大學實驗動物管理辦法》以及《清華大學實驗動物福利倫理審查辦法》等文件的規定,要求從事實驗動物飼養、管理或動物實驗研究等相關工作的人員必須持有《實驗動物從業人員崗位證書》(以下簡稱上崗證)。為了滿足清華大學新增動物實驗人員的需求,以及每5年需要更新上崗資質的要求,清華大學實驗動物中心每學期會聯合北京實驗動物行業協會,對校內有需求的從業人員進行培訓并組織資格考試。對于未能參加上崗證考試,但急需開展動物實驗的人員,中心提出三點要求:一是實驗者需要有經IACUC審批通過的有效實驗動物研究及使用計劃(Animal Protocol,以下簡稱AP);二是需在開展動物實驗前完成動物中心組織的動物實驗操作及屏障使用等培訓,取得動物中心屏障設施門禁卡權限;三是在獲得上崗證之前,實驗者不能獨自開展動物實驗,需在已考取上崗證的實驗者帶領下進行動物輔助操作實驗。

清華大學實驗動物中心為本校師生提供具有針對性的實驗動物相關培訓,以幫助他們能夠快速掌握實驗操作技能,實驗者可通過實驗動物中心的網站預約培訓,培訓包括基本的屏障設施使用理論及實操培訓(每周至少一次)、常規基礎實驗技術系列培訓(每兩周一次)、一對一的特殊手術技能培訓(根據預約情況決定)、ABSL-2實驗相關的理論及實操培訓(每兩周一次)以及測試相關儀器上機培訓(根據預約情況決定)。據后臺數據統計,每年培訓已達1 200人次以上,極大的為校內師生動物實驗的開展提供了便利。

1.1.2AP的審查及更新檢查:AP是科研工作者開展動物實驗之前必須準備的重要文件,內容包括使用實驗動物的原因、需要對實驗動物進行的操作,以及為保障實驗動物福利采取的有效措施。IACUC的主要職能工作之一是對AP的審查,通過權衡動物實驗設計的科學性與實驗動物福利間的平衡,分析動物實驗涉及的生物安全風險,從而提出適當的安全防護建議及整改方案。一份新的AP從提交、審閱、修改到最終批準,大約需要兩周時間。

自2020年春季學期開始,本中心不斷增強所提供的服務與AP之間的關聯,從開通門禁卡、參加動物中心各項培訓到訂購實驗動物、申請麻醉劑、申請《實驗動物福利倫理審查證明》等均需在有效的AP指導下進行。IACUC對實驗者提交的各項服務預約申請進行AP有效性審查,對于無效AP會督促實驗室提交重大變更申請或后續調整申請。清華大學實驗動物中心IACUC在2021年度共審閱并批準AP 125份,審閱已獲批實驗計劃的延期及變更申請69份,后續調整申請206份。

1.2 實驗動物供應商的選擇和質量保障

清華大學科研工作者對實驗動物的種類、品系要求多樣,除了使用動物中心常規飼養繁育的3萬多籠動物以外,每年仍需要從其他機構購買約15萬只實驗動物,包括大鼠、小鼠、兔子等,因而,對實驗動物供應商的質量評估也納入了本中心獸醫的工作范圍。作為實驗動物質量保障的重要環節,中心獸醫需每年對每個供應商至少進行一次綜合評估,重點是對實驗動物質量進行評價,涵蓋微生物質量、遺傳質量和生理生化等表型。此外,綜合評估還包括供應商的質量控制體系完善程度,供應商的售后服務保障和用戶體驗等。

1.3 實驗動物基礎物料選擇與質量保障

1.3.1墊料:墊料,用于吸附水分和動物的排泄物,以維持動物自身和籠內環境的清潔衛生。為了防止對動物實驗造成干擾,所選用的墊料應不含揮發性、刺激性物質,且對動物無毒害。嚙齒類實驗動物墊料主要包括楊木屑、玉米芯和紙卷。綜合考慮取材難易程度及成本,美國多選用碎玉米芯作為墊料,而歐洲國家多選用白楊木屑作為墊料。一般認為,玉米芯墊料具有粉塵少,吸附氨類物質能力強[1],對動物及設備損害小的優點,但是舒適性差,不適合動物做窩,吸水性不好,且可能影響小鼠的代謝、免疫功能以及繁殖[2],常規可搭配紙卷加以改善[3]。紙卷由于成本較高,往往不單獨使用。而楊木屑雖然便于動物做窩,利于保暖,降低能量消耗,更為動物喜愛[4-5],但是對設備損害較大,尤其是可能導致自動飲水系統的飲水水閥漏水。因此,為了使墊料兼顧良好的吸附性、舒適度,同時降低對設備的損壞,本中心對玉米芯分別搭配紙卷和楊木屑做墊料的實際使用效果進行比較后,進一步優化墊料組成成分,改進木屑為更輕盈松軟的刨花[6]。目前本中心使用玉米芯搭配低粉塵楊樹刨花作為大小鼠墊料,據繁育數據統計,在這種墊料飼養環境中本中心自繁C57BL/6J小鼠的產仔率穩定在8.5只/窩。

1.3.2飼料:飲食是實驗動物健康和福利保障的重要組成部分,不同的飲食選擇對小鼠的發育和腸道菌群有重大影響,并直接影響研究結果的準確性和可重復性。

飼料按照滅菌方法不同,主要分為60Co輻照滅菌和高壓滅菌兩種,已有研究表明60Co輻照滅菌法對飼料營養成分破壞較少,而高壓蒸汽滅菌法對飼料營養成分破壞較多,尤其是會導致熱敏感維生素(維生素A, B12, E等)的大量流失[7],因此本中心選用60Co輻照滅菌的飼料。然而,輻照后的飼料并不能保證完全無菌,輻照滅菌的效果與照射劑量和時間有關,還與病原污染的起始劑量相關。已有研究表明,飼料的制造過程并不能完全消除病原體,如果飼料病原載量過高,小鼠甚至有感染穆林帕沃病毒(murine parvovirus)的風險[8]。

因此,為了保障飼料質量,我們除了對購買飼料的外觀進行嚴格檢查,并跟蹤每批次飼料的檢測報告和質量合格證外,還不定期對飼料進行抽檢,將抽檢的樣本送到第三方檢測機構測試其營養成分和細菌含量,以確保各項指標符合國家標準。抽檢頻率為每年2～3次,抽檢項目參考相關標準輪流進行,以保證全年能檢測所有項目。嚴格的飼料質量把控,使我們中心小鼠分籠后體質量增長穩定,與JAX實驗室相當(圖1)。

1.3.3飲水:飲水同樣是小鼠健康和福利保障中重要的組成部分。目前,行業內使用的實驗動物飲水主要有反滲透水、酸化水(pH值為2.8～3.1)以及次氯酸水(游離氯0.2～1 ppm)。其中酸化水會導致腸道細菌數量及豐度下降[9],但是因其具有可抑制動物胃腸道病原體(例如假單胞菌)生長的優點,仍是最為廣泛使用的嚙齒動物飲水(如JAX實驗室)。本中心二期新設施全部采用自動飲水裝置,根據廠家推薦,采用的動物飲水是氯化水。為確保動物飲水符合國家實驗動物環境標準,中心每月進行1次飲水的無菌狀態檢測,每年進行2次重金屬含量檢測。

2 實驗動物專業技術服務項目的選擇和建立

2.1 小鼠進出口業務

隨著清華大學在生命科學領域國際地位的提升,校內研究者對全球小鼠資源的需求,以及開放共享自己小鼠的需要均日益增長,因此中心申請獲得了從國內外院校、科研院所、實驗動物資源機構(如JAX等機構)進出口活體小鼠(包括無菌小鼠)或其遺傳物質的資質,義務幫助校內師生操作進出口業務,為清華大學生命學科與全球資源的聯動提供便捷,全方位滿足實驗動物的進出口需求。

2.2 基因修飾小鼠技術服務

2.2.1小鼠生物凈化:為保障本中心飼養的小鼠質量符合國標無特定病原體(specific pathogen free, SPF)的潔凈等級,外來動物只有進行生物凈化(bio-rederivation)后才可以進入屏障設施內的繁育房間。目前常用的凈化方法包括體內交配進行胚胎移植(embryo transfer,ET)和體外受精(in vitro fertilization,IVF)后胚胎移植[10]。截至2021年,動物中心已經為190余位PI的4 100余個小鼠品系進行生物凈化,其中僅2021年動物中心完成966個品系,其中自然交配方式271個,得到5 350枚2細胞期胚胎,生仔2 030只,體外受精方式695個,得到94 883枚2細胞期胚胎,生仔23 187只。每個品系從提出申請到進入屏障約為50 d,為生命學科的快速發展提供了保障。

2.2.2基因工程小鼠制作:2000年以來,CRISPR/Cas9基因修飾技術的問世,極大加速了對實驗動物進行基因修飾的效率,進而催生了數以萬計的基因工程動物模型。基于CRISPR/Cas9的優勢,本中心及時將原有胚胎干細胞打靶(ES cell targeting)技術替換為更高效的CRISPR/Cas9制作方式。中心制作的基因修飾小鼠主要包括基因敲除(knockout,KO)、基因敲入(knockin,KI)以及轉基因(transgene,Tg)。截至2021年為本校科研人員提供了347種基因工程小鼠,涉及基因300余個,提升了生命學科研究的時效性(表1)。

表1 2021年清華大學實驗動物中心基因工程小鼠制作統計(n)

2.2.3體外受精(IVF)技術:為保證數據的可重復性、可比較性,實驗中通常需要較大數量相同年齡、性別、品系的小鼠,若使用常規繁育的方式耗時耗力,中心通過快速擴繁方式幫助科研人員縮短獲得相同實驗小鼠的等待時間,以提高科研效率。IVF技術是實現快速擴繁的核心,將1～2只雄鼠活化后的精子與超排雌鼠的卵母細胞進行體外受精,然后將受精卵移植入假孕母鼠體內,一次可以獲得大量出生日期接近的子代小鼠。相比傳統的交配繁殖,IVF技術至少擁有以下優勢:(1)無需等待生理性成熟時間,45 d即可獲得多達百只子代;(2)子代小鼠出生日期一般相差2～3 d,便于實驗分組;(3)可嚴格控制后代動物質量。截至2021年,中心共進行了123次IVF擴繁,獲得子代20 007只,平均162只/次。

此外,如果科研工作者遇到小鼠無法正常交配繁殖,或小鼠突發不明原因死亡的狀況,也能夠通過IVF和卵巢移植技術及時挽救。在小鼠死亡后幾個小時內,采集附睪尾或卵巢,再通過IVF或卵巢移植方式獲得子代。目前,中心已經成功挽救10余例珍貴小鼠品系,有效降低了品系丟失的風險。

2.2.4小鼠附睪運輸與保存及IVF服務:活體小鼠的長途運輸對于溫度和時效性要求高,且價格昂貴,甚至存在小鼠被微生物或寄生蟲污染,以及運輸途中小鼠逃跑或死亡的風險。本中心在國內首次建立了附睪、輸卵管的冷藏運輸法,可有效避免以上風險,且操作簡單。目前,本中心既可提供低溫保存附睪、冷鏈運送的服務,亦可接收對方冷鏈運輸至清華的附睪,并提供IVF復蘇附睪用于繁殖的服務。這樣,既可以降低活體小鼠運輸的成本和風險,又達到了生物凈化(去除微生物和寄生蟲污染)的目的。

2.2.5小鼠胚胎/精子冷凍保種與復蘇服務:當一個研究課題取得階段性成果后,一些小鼠品系可能會暫停使用,如果持續保持活體繁育,不僅占用時間和空間,同時也會浪費飼養和鑒定費用,為此我們提供了冷凍保種與復蘇服務。冷凍保種即將小鼠的精子或胚胎凍存在液氮中(長期免費保存),待需要時,再將凍存的精子或胚胎復蘇獲得后代。目前,中心共有5個液氮罐(175 L/個),共存放精子1 660個品系,30 227麥管;凍存胚胎260個品系,共計66 493枚胚胎,已逐步發展成為一個小型共享的小鼠資源庫。

2.3 動物質量保障、健康巡查、疾病診斷與護理等獸醫技術服務

2.3.1動物質量檢測和保障:為方便國際交流與小鼠出口業務,除國家標準(GB 14922.1—2011和GB 14922.2—2011)中要求的SPF級微生物和寄生蟲的檢測項目,以及一些必要時的檢測項目外,本中心還按照國際慣例增加了其他國家地區的關注項目,包括Murine Norovirus(MNV)、K-virus(KV)、Lactate dehydrogenase-elevating virus(LDEV)、Mouse kidney parvovirus(MKPV)等。此外,結合中心歷年動物質量檢測結果,以及動物不同的使用目的,本中心將屏障設施劃分為不同的防疫級別,并細分房間用途,定制化每個房間的檢測項目和頻率,保證所有項目全覆蓋的同時,兼顧經濟性,節約檢測成本(表2)。

表2 2021年清華大學實驗動物中心不同用途小鼠檢測項目及頻率設置

2.3.2動物健康巡查、疾病診斷及護理:為保障實驗動物的健康,本中心獸醫每周至少進行一次動物健康巡查,結合飼養人員及研究人員的反饋,檢查并照料每只健康狀態不良的動物。同時,中心會對動物健康問題進行分類總結,針對每一類健康問題,制定相應的標準操作規程,保障了動物福利和實驗的順利進行。此外,若中心出現動物死亡的情況,獸醫會做好剖檢記錄,提供診斷結果,及時總結并整改潛在的影響因素,保障飼養和操作的準確性。

2.4 代管技術服務研發及MyMice小鼠管理軟件制作

2019年受新冠疫情影響,大量科研工作者被隔離,動物中心及時推出了針對繁殖保種小鼠的免費代管技術服務,保障了科研人員小鼠的穩定繁殖,并進一步提升了小鼠質量的穩定性,促進了科研人員返崗后的“科研回歸”。本中心的代管技術服務結合了我們自主開發的MyMice實驗動物管理軟件,實現了在校科研人員對小鼠的遠程可視化管理,幫助他們從日常剪尾分籠等繁雜的小鼠管理工作中解放出來,同時也降低了飼養以外人員接觸繁殖保種小鼠頻次,便于更好地進行對微生物和寄生蟲的控制。

目前中心自主研發并且已經在線運行的實驗動物管理軟件MyMice,可方便科研工作者隨時隨地查看實驗動物信息、狀態、所在籠位等內容,同時可以便捷的通過軟件提出各種操作申請(剪尾、取鼠、建立繁殖籠、采血等實驗操作),遠程完成常規的實驗動物管理工作。此外科研工作者還可以通過該軟件和中心的技術員即時互動,以進行特殊需求說明。MyMice采用B/S結構設計,擁有良好的跨平臺能力和兼容性,只需設備支持瀏覽器和網絡服務,即可使用。且該軟件的操作界面簡單直觀,無論是代管技術員還是普通用戶,經過簡單的培訓即可快速掌握,為實驗動物管理工作提供便利。

2.5 表型分析中心的建立

為了幫助清華大學在校師生對實驗動物的表型進行分析,本中心建立了表型分析平臺,其中包括小動物能量代謝系統、小動物活體成像系統、小動物活體和細胞的X-Ray輻照系統、組織病理制片和攝片系統。此外,隨著我國神經科學領域的蓬勃發展,本中心在二期啟用后對一期設施進行改造,并成立行為學表型分析系統,旨在為神經科學領域的科研工作者提供小動物行為學研究平臺。

2.5.1小動物能量代謝系統:小動物能量代謝系統主要包括小動物體脂成分分析(EchoMRI)和TSE八通道小動物代謝監測系統(含小鼠跑步機模塊)。可以為糖尿病、肥胖、內分泌等代謝相關疾病或藥物篩選、藥理研究以及營養學相關研究提供服務。

2.5.2小動物活體成像系統:小動物活體成像系統主要包括用于活體熒光成像的IVIS Lumina II和IVIS Spectrum 3D,以及Quantum MicroCT。小動物活體熒光成像系統可以應用于材料學、神經科學、代謝學、免疫學等的研究和相關疾病藥物的篩選。小動物MicroCT成像系統利用X線進行三維斷層掃描成像,其使用極低的X線劑量實現對活體動物的長時程成像,此外還可以與IVIS Spectrum 3D聯用,進行數據融合,可廣泛應用于骨骼、器官、軟組織、腫瘤、心血管等相關結構變化的研究。

2.5.3小動物和細胞X線輻照系統:本中心有基于X線的輻照裝置(Rad Source RS2000 pro),能為活體小動物以及細胞提供輻照服務,目前已廣泛應用于干細胞、骨髓移植、腫瘤學、免疫學、基因組學等的研究和相關藥物的研發中。基于輻照操作的特殊性,本中心從事放射相關工作人員均需完成放射防護和有關法律知識培訓,并獲得放射人員操作資格證書。此外,中心的輻照儀每季度會請專業機構進行校準及設備維護,以保證使用安全與輻照劑量的準確性。

2.5.4組織病理制片、攝片系統:本中心組織病理制片、攝片于病理室進行,病理室具有全自動脫水機、石蠟包埋機、全自動組織細胞多功能染色機、全自動蓋片機、組織切片機(如石蠟切片機、冷凍切片機、震蕩切片機)以及顯微成像系統,可以提供從制片、染色到攝片的全周期系列服務。2021年病理室月均包埋1 495塊,切片2 535張,HE染色1 650張,總計為校內109位PI,353名學生提供了病理學相關服務。

2.5.5行為學表型分析系統:行為學表型分析中心占地237 m2,包括19個測試房間,已支持至少34種行為學范式的測定,其中包括基本冷、熱、痛覺(Von Frey纖維絲測痛儀、冷熱板)與震驚反射測試,基本運動功能測試(跑步機、轉棒儀、爪抓力測試、平衡木、步態分析儀),焦慮(曠場實驗、高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗)以及抑郁(強迫游泳、懸尾、糖水偏好)相關的情緒測試,社交障礙模型的制備和測試(慢性社交挫敗應激模型的制備、管型社會支配實驗、三箱社交測試),學習記憶測試(如水迷宮、巴恩斯迷宮、Y迷宮、條件性恐懼實驗等),生物節律監測系統(自主活動轉輪系統)和氣候對動物影響的監測系統。這些行為范式除了廣泛應用于神經科學的研究,還應用于免疫學、結構生物學、材料科學、環境科學以及計算神經科學等領域。

2.6 其他新技術的開發

近年來,腸道菌群的相關研究已成為生命科學研究中的熱點領域之一,對無菌小鼠以及小鼠的無菌化服務與日俱增。為跟上科研工作者步伐,本中心成功建立了無菌小鼠繁育體系。繁育環境通過了北京市科學技術委員會頒發的實驗動物使用許可證(隔離環境:小鼠)。無菌小鼠通過了多次檢測,質量符合無菌要求。

3 環境控制系統的保障和維護

設施環境的潔凈度、房間壓差、溫度、相對濕度、氨氣濃度及照度等是保障實驗動物質量的重要環境參數,因此進行屏障環境、實驗動物設施的日常維護以確保其持續正常運行,同時提供具有標準化和窄幅變化范圍的環境空間是必要的。

為了實現以上目的,本中心的屏障設施交由維保專職技術人員運行管理,全年24 h監控設施設備的運行狀態,確保出現異常情況時能夠第一時間響應,并及時調試至正常狀態,保障設施環境的穩定性。

4 人才培養及隊伍梯隊建設

本中心目前工作人員77名,其中以博士、碩士為核心的技術人員14名,占18%,主要從事獸醫、基因修飾小鼠制作、平臺大型儀器管理和表型分析、人員培訓等工作。此外,本科、大專人員16名,占比21%,主要為核心技術人員提供輔助,在核心技術人員的安排以及指導下開展具有一定技術難度的工作。

本中心工作內容多樣,主要通過平臺主管進行分級管理,并且每年對平臺主管進行考核,破除“唯學歷”“唯職稱”的用人弊端,建立正確的用人導向。針對科研平臺技術團隊中事業編制和非事業編制人員并存的實際狀況,結合高校人事制度改革,本中心配合學校在人員聘用與合同管理、技術職務評審與內部職級評定、薪酬及休假等方面進行了一些探索性的趨同化管理實踐。不斷改良管理方式,以保持不同編制類型人員技術職務評審的公平性,保證工作人員的個人發展空間,不斷提高自身技術服務水平,提高設備利用效率和平臺的技術支撐能力,進而增強職業認同感,保持高昂的工作積極性。

5 結語

清華大學實驗動物中心自2009年成立,已經走過十余年。隨著大生命科學相關學科的發展,科研工作者的需求逐漸由基礎、單一化向高階、多元化升級,我們中心始終和清華大學的科研工作者并肩同行,為我校實驗動物研究提供良好的平臺保障。實驗動物中心的發展離不開學校各相關部門的大力支持和幫助,是多部門協力共筑的科研基石。下一個十年,實驗動物中心將立足學校的學科發展要求,進一步完善中心功能并提升服務質量,全力為學校的科研教學工作發展保駕護航,為清華大學生命學科力爭世界一流的科研目標提供強有力的支撐。