六味地黃丸和通絡(luò)救腦滴丸對(duì)2種癡呆模型小鼠腦組織Aβ降解的影響

賈亞泉 宋軍營(yíng) 曾華輝 謝治深 張紫娟 袁 永 原 野 張振強(qiáng) 狄 波

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院,鄭州,450046; 2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院,北京,100700)

癡呆主要以認(rèn)知和自理能力下降為主要表現(xiàn),其發(fā)病與腎、心、脾、肝等臟腑功能失調(diào)密切相關(guān)。因腎精生髓通于腦,若腎精虧耗,髓海不足,腦元失養(yǎng)而“腎精不足”致呆;因憂愁思慮,痰蒙心竅,致七情不遂使臟腑功能失調(diào),氣滯血瘀而“毒損腦絡(luò)”致呆。本文在此中醫(yī)病機(jī)理論指導(dǎo)下,以補(bǔ)腎填精,解郁散結(jié)治法,采用SAMP8小鼠建立“腎精不足”證癡呆動(dòng)物模型和SAMR1小鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-40建立“毒損腦絡(luò)”證癡呆動(dòng)物模型,比較2種癡呆模型的差異,通過(guò)六味地黃丸和通絡(luò)救腦滴丸分別對(duì)此2種癡呆癥進(jìn)行治療,采用免疫印跡法(Western Blotting法)檢測(cè)調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ代謝的關(guān)鍵蛋白胰島素降解酶(Insulin-degrading Enzyme,IDE)、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白1(Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein 1,LRP1)和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation end Products,RAGE)的表達(dá),探討六味地黃丸和通絡(luò)救腦滴丸對(duì)不同擬老年癡呆癥模型小鼠腦組織中Aβ降解的作用特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)SAMP8小鼠,雄性,32周齡,48只;SPF級(jí)SAMR1小鼠,雄性,32周齡,68只,購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2020-0004。動(dòng)物購(gòu)回后飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,使用許可證號(hào):SYXK(豫)2021-0015,期間自由飲食,飼養(yǎng)溫度控制在(22±1)℃,相對(duì)濕度(45±5)%,照明每12 h明暗交替1次。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(倫理審查號(hào):DWLL201911028)。

1.1.2 藥物 六味地黃丸(河南宛西制藥股份有限公司,批號(hào):18110401)、通絡(luò)救腦滴丸(由梔子、三七組成,具有解營(yíng)衛(wèi)之毒、活血通絡(luò)之功效,天津紅日藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):090603);鹽酸多奈哌齊片(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司,批號(hào):1701069)。

1.1.3 試劑與儀器 Aβ1-40(Sigma,德國(guó),貨號(hào):A1075),Aβ抗體(Abcam,英國(guó),貨號(hào):Ab11132),IDE抗體(Abcam,英國(guó),貨號(hào):Ab25970),RAGE抗體(Abcam,英國(guó),貨號(hào),Ab37647),LRP1抗體(Epitomics,美國(guó),貨號(hào):2703-1),抗β-Actin鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號(hào):CW1313),DAB試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號(hào):CW0211),UltraSensitive S-P(Goat)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,貨號(hào):KIT-9709),放射免疫沉淀測(cè)定(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):P0013B),二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):P0012)。小動(dòng)物腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):68003)、Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):63031),超聲細(xì)胞破碎儀(Sonics,美國(guó),型號(hào):VCX130),電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀(Bio-rad,美國(guó),型號(hào):P3000),電子天平(上海精密儀器儀表有限公司,型號(hào):YP600),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo,美國(guó),型號(hào):MK3),光學(xué)顯微鏡(Leica,德國(guó),型號(hào):DM500B)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 SAMR1小鼠分為空白對(duì)照組(N組)12只;模型一組(A組)、陽(yáng)性對(duì)照組(AY組)、六味地黃丸組(AL組)和通絡(luò)救腦滴丸組(AT組),每組14只。SAMP8小鼠分為模型二組(P組)、陽(yáng)性對(duì)照組(PY組)、六味地黃丸組(PL組)和通絡(luò)救腦滴丸組(PT組),每組12只。

1.2.1.2 雙側(cè)海馬注射Aβ1-40動(dòng)物模型制備 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后對(duì)SAMR1小鼠除空白對(duì)照組進(jìn)行造模。造模前12 h對(duì)動(dòng)物進(jìn)行禁食不禁水處理。動(dòng)物麻醉后,將動(dòng)物腹位固定在腦立體定位儀上,剃除頭頂部手術(shù)區(qū)毛發(fā),用碘伏消毒后做0.5 cm左右縱向切口,參照大鼠腦立體定位圖譜在前囟后2.3 mm,中線左右各1.8 mm,用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨,暴露硬腦膜,用微量進(jìn)樣針自腦表面進(jìn)針2 mm,每側(cè)注射Aβ1-40溶液0.5 μL,進(jìn)樣時(shí)間3 min,注射后留針3 min,之后用1 min時(shí)間緩慢撤針,肌內(nèi)注射青霉素G 10萬(wàn)U/d,連續(xù)注射3 d,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法 參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》計(jì)算給藥量,六味地黃丸(LWDH)3.333 g/(kg·d)、通絡(luò)救腦滴丸(TLJN)0.618 g/(kg·d)、鹽酸多奈哌齊片(YSDNPQ)1.667 mg/(kg·d),每天所需藥量溶于1 mL去離子水中。Aβ1-40溶液的配制:將Aβ1-40溶于無(wú)菌生理鹽水,參照Prediger的實(shí)驗(yàn)配置,使1 μL溶液含有400 pmol的Aβ1-40,將溶液在37 ℃恒溫水浴中孵育4 d備用。在造模成功后第2天開(kāi)始,每天早、晚8點(diǎn)各1次進(jìn)行灌胃給藥,每次灌胃量根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算給藥體積。其中,N組、A組、P組給予等量去離子水,AL組、PL組給予六味地黃丸溶液,AT組、PT組給予通絡(luò)救腦滴丸溶液,AY組、PY組給予鹽酸多奈哌齊片,連續(xù)給藥14 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 行為學(xué)測(cè)試 1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):各組動(dòng)物均于A模型造模后第15天適應(yīng)性游泳60 s。第16天起正式測(cè)試,先將動(dòng)物放在平臺(tái)上適應(yīng)10 s進(jìn)行空間定位。動(dòng)物放入水中后,軟件開(kāi)始計(jì)時(shí),從入水到找到平臺(tái)所需的時(shí)間為逃避潛伏期。在60 s內(nèi)找到平臺(tái)并停留超過(guò)2 s者為尋的成功,其潛伏期為實(shí)際所用時(shí)間;否則為尋的失敗,其潛伏期為60 s。每次測(cè)試后將動(dòng)物再次放置在平臺(tái)上適應(yīng)10 s。每只動(dòng)物從未放置平臺(tái)的3個(gè)象限依次測(cè)試1次,連續(xù)測(cè)試3 d。2次測(cè)試間隔3 h。每天動(dòng)物測(cè)試順序、入水象限、測(cè)試時(shí)段保持一致。2)避暗實(shí)驗(yàn):水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天進(jìn)行,電刺激30 V。避暗實(shí)驗(yàn)第1天,將小鼠放到明室自由活動(dòng),當(dāng)小鼠進(jìn)入暗室時(shí),關(guān)閉明暗室之間的通道門,同時(shí)暗室通電,電刺激小鼠5 s后取出。24 h后將小鼠再次放入明室,測(cè)試時(shí)間5 min。從測(cè)試開(kāi)始到小鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間為避暗潛伏期,測(cè)試期間進(jìn)入暗室的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù),在暗室停留的時(shí)間為錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間。

1.2.3.2 免疫組化法檢測(cè)海馬與皮層Aβ的表達(dá)情況 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,將小鼠快速斷頭處死,在冰上取出全腦,除去小腦,投入4%多聚甲醛溶液固定24 h后取出,常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,片厚6 μm。常規(guī)脫蠟脫水,用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,熱修復(fù)抗原,滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,滴加1∶100稀釋的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。滴加二抗37 ℃溫箱孵育20 min,滴加SABC,37 ℃溫箱20 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水封片。顯微鏡下觀察拍照,采用Image-Pro-Plus 7.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)其平均光密度值。

1.2.3.3 Western Blotting法檢測(cè)海馬和皮層IDE、LRP1、RAGE等蛋白的表達(dá)情況 在冰盤(pán)上快速取出小鼠全腦,分離雙側(cè)海馬及皮層,提取總蛋白,定量。取總蛋白樣品25 μg,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜,放入37 ℃恒溫?fù)u床,60 r/min,封閉1 h。將膜浸入用封閉液稀釋的一抗(IDE 1∶200、LRP1和RAGE 1∶1 000),4 ℃恒溫?fù)u床,60 r/min孵育。TBST洗膜3次。將膜浸入用封閉液稀釋的二抗(1∶10 000),37 ℃恒溫?fù)u床,60 r/min,孵育1 h。TBST洗膜3次。滴加ECL后放入暗盒曝光,掃描圖片,Image J分析軟件比較灰度值。

2 結(jié)果

2.1 LWDH和TLJN對(duì)2種模型小鼠行為功能學(xué)的影響

2.1.1 MWM逃避潛伏期的組間比較 與N組比較,2種模型組訓(xùn)練各天的逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2種模型各觀察組逃避潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短,與N組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);AL組、AT組與A組比較,訓(xùn)練各天逃避潛伏期均縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但AL組與AT組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);PL組與P組比較,從訓(xùn)練第2天起逃避潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但與PT組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠的逃避潛伏期注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型比較,△P<0.05

2.1.2 MWM尋臺(tái)成功率的組間比較 與N組比較,兩模型各組尋臺(tái)成功率均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),但各組隨訓(xùn)練天數(shù)的增加尋臺(tái)成功率均有提高趨勢(shì);與A組比較,AL組訓(xùn)練各天尋臺(tái)成功率均提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AL組和AT組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與P組比較,PL組從訓(xùn)練第2天起尋臺(tái)成功率提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與PT組比較,PL組訓(xùn)練各天的尋臺(tái)成功率均較高,至第3天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠的尋臺(tái)成功率注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型比較,△P<0.05,△△P<0.01;與PT比較,▲▲P<0.01

2.1.3 MWM平均游速的組間比較 與N組比較,A模型各組游速差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但P模型各組游速差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。A模型與P模型組間游速差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠的游速注：與N組比較,**P<0.01;2種模型之間,與A組比較,△△P<0.01

2.1.4 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 2種模型各組的避暗潛伏期均明顯縮短,與N組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);單模型間,A模型中AT組與A組、AY組和AL組比較避暗潛伏期延長(zhǎng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);P模型中PL組與P組、PY組和PT組比較避暗潛伏期延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠的避暗潛伏期注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05;與AL組比較,▲P<0.05;與PT組比較,□□P<0.01

2種模型各組的避暗錯(cuò)誤次數(shù)有所增加,與N組比較,A組、AL組、P組和PT組錯(cuò)誤次數(shù)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);單模型內(nèi),A模型中觀察組與模型組比較,避暗錯(cuò)誤次數(shù)均有不同程度減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);P模型中觀察組與模型組比較,避暗錯(cuò)誤次數(shù)有減少趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);P組與A組比較,避暗錯(cuò)誤次數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠的避暗錯(cuò)誤次數(shù)注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;2種模型之間,與A組比較,▲P<0.05

2種模型各組的避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間均增加,與N組比較,僅A組避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);單模型間,A模型中觀察組與模型比較,避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);P模型中各組避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);P組與A組比較,避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠的避暗錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;2種模型之間,與A組比較,▲▲P<0.01

2.2 LWDH和TLJN對(duì)2種模型小鼠腦組織皮層和海馬Aβ的影響 在皮層和海馬組織中,N組神經(jīng)元形態(tài)完整,排列整齊,無(wú)明顯Aβ陽(yáng)性染色。A組、P組均可見(jiàn)少量Aβ陽(yáng)性斑塊,膠質(zhì)細(xì)胞增生。A模型和P模型的各觀察組Aβ陽(yáng)性斑塊有不同程度減少。見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠腦組織海馬與皮層Aβ的表達(dá)情況

在皮層組織中,僅A組Aβ蛋白表達(dá)與N組有不同程度增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在海馬組織中,除PL組外,其余各組Aβ蛋白表達(dá)與N組均有不同程度增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與PT組比較,PL組海馬Aβ蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠腦組織皮層和海馬中Aβ的表達(dá)水平注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;與PT組比較,▲▲P<0.01

2.3 LWDH和TLJN對(duì)2種模型小鼠腦組織皮層和海馬IDE的影響 與N組比較,A組皮層、海馬IDE表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);P組皮層、海馬IDE表達(dá)有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

經(jīng)不同藥物治療后,AT組海馬IDE表達(dá)降低至與N組無(wú)差異,且明顯低于A組(P<0.01);AT組與AL組比較,海馬組織IDE蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PL組皮層、海馬IDE表達(dá)均明顯升高,與N組、P組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PL組與PT組比較,皮層、海馬組織IDE蛋白表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2種模型之間,與A組比較,P組皮層和海馬IDE蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖9～10。

圖9 各組小鼠腦組織皮層和海馬中IDE的表達(dá)水平注：與N組比較,*P<0.05,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△△P<0.01;與AL比較,▲▲P<0.01;與PT比較,□□P<0.01;2種模型之間,與A組比較,■■P<0.01

圖10 Western Blotting法檢測(cè)各組皮層和海馬IDE表達(dá)情況

2.4 LWDH和TLJN對(duì)2種模型小鼠腦組織皮層和海馬LRP1的影響 與N組比較,A組皮層LRP1表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而海馬LRP1表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);P組皮層、海馬LRP1表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

經(jīng)不同藥物治療后,AL組與AT組皮層、海馬LRP1表達(dá)均比A組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);與AL組比較,AT組皮層LRP1表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PL組皮層、海馬LRP1表達(dá)均升高,與P組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與PT組比較,PL組皮層、海馬LRP1表達(dá)均有不同程度升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。2種模型之間,與A組比較,P組海馬LRP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖11～12。

圖11 各組小鼠腦組織皮層和海馬中LRP1的表達(dá)水平注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;與AL比較,▲▲P<0.01;與PT組比較,□□P<0.01;2種模型之間,與A組比較,■■P<0.01

2.5 LWDH和TLJN對(duì)2種模型小鼠腦組織皮層和海馬RAGE的影響 與N組比較,A組與P組皮層、海馬RAGE表達(dá)均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。經(jīng)不同藥物治療后,AT組海馬RAGE表達(dá)降低,與A組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AT組與AL組比較,海馬RAGE表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PL組皮層、海馬RAGE表達(dá)降低,與P組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但皮層RAGE表達(dá)降低至與N組無(wú)差異;PL組與PT組比較,皮層RAGE表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2種模型之間,P組與A組比較,皮層和海馬RAGE蛋白表達(dá)均更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)圖12～13。

圖12 Western Blotting法檢測(cè)各組皮層和海馬LRP1表達(dá)情況

圖13 各組小鼠腦組織皮層和海馬中RAGE蛋白的表達(dá)水平注：與N組比較,**P<0.01;與各自模型(A組/P組)比較,△P<0.05,△△P<0.01;與AL組比較,▲▲P<0.01;與PT組比較,□P<0.05;2種模型之間,與A組比較,■P<0.05,■■P<0.01

圖14 Western Blotting法檢測(cè)各組皮層和海馬RAGE表達(dá)情況

3 討論

癡呆是一種隨著年齡增長(zhǎng)、病情不斷加重的神經(jīng)退行性疾病[1],歷代醫(yī)家認(rèn)為腎精虧損,腦髓化生不足為其主要病因,臨床上以益精填髓為主要治法[2]。Aβ1-40通過(guò)損傷細(xì)胞器及細(xì)胞骨架而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起海馬前炎癥介質(zhì)表達(dá)增多、氧化反應(yīng)增強(qiáng),觸發(fā)AD病變級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)空間記憶障礙,學(xué)習(xí)記憶能力減退[3]。SAMP8小鼠是快速老化小鼠品系中的一個(gè)亞系,主要以學(xué)習(xí)、記憶障礙為主要特征,是目前公認(rèn)的自然衰老癡呆模型[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)海馬注射Aβ1-40和自然飼養(yǎng)至32周齡的SAMP8小鼠復(fù)制癡呆動(dòng)物模型,與空白對(duì)照組比較,2種模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),尋臺(tái)成功率降低,避暗潛伏期縮短,說(shuō)明2種模型小鼠均出現(xiàn)了癡呆癥狀。且雙側(cè)海馬注射Aβ1-40模型組和32周齡SAMP8小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均死亡了2只,兩模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,生理?xiàng)l件下外周和中樞內(nèi)Aβ水平保持平衡[5]。若腦內(nèi)Aβ清除功能下降,導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)堆積,則引發(fā)突觸功能異常、神經(jīng)元凋亡等多種病理反應(yīng)[6]。IDE在清除腦內(nèi)Aβ的過(guò)程中起重要作用,其表達(dá)升高與Aβ斑塊減少有直接關(guān)系[7]。LRP1是低密度脂蛋白受體家族成員之一,LRP1通過(guò)與Aβ直接結(jié)合,或通過(guò)LRP1配體與Aβ結(jié)合后,將腦內(nèi)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)至血液[8-10]。RAGE是一種多功能受體,屬免疫球蛋白超家族,廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞等表面,是BBB上將Aβ從血液轉(zhuǎn)運(yùn)入腦組織的主要受體[11-14],與LRP1是一對(duì)作用相反的蛋白。BMECs細(xì)胞膜上的RAGE與Aβ結(jié)合后,可促使Aβ穿過(guò)BBB后在腦內(nèi)積聚[15],并激活小膠質(zhì)細(xì)胞,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),生成ROS,促進(jìn)凋亡,同時(shí)促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá),引起炎癥反應(yīng)[16-18]。另外,神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞上的RAGE也可與Aβ結(jié)合,激活小膠質(zhì)細(xì)胞,引發(fā)AD相關(guān)病理過(guò)程[19-21]。

本研究結(jié)果表明,2種模型在神經(jīng)行為學(xué)的水迷宮游速、避暗實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)、錯(cuò)誤區(qū)時(shí)間等活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo),和腦組織海馬和皮層中IDE、RAGE和海馬中LRP1等蛋白的表達(dá)上,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。SAMP8模型小鼠的水迷宮游速和避暗錯(cuò)誤次數(shù)下降,腦組織中RAGE表達(dá)升高,IDE和LRP1表達(dá)降低,反映了腎虛精乏證模型的Aβ代謝障礙更嚴(yán)重。給予LWDH和TLJN治療后,TLJN對(duì)改善雙側(cè)海馬注射Aβ1-40模型小鼠的避暗潛伏期、腦組織海馬區(qū)IDE和RAGE的表達(dá)水平作用明顯,而LWDH對(duì)上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用不如TLJN;LWDH對(duì)改善SAMP8模型小鼠水迷宮尋臺(tái)成功率、避暗潛伏期、腦組織皮層和海馬區(qū)IDE表達(dá)和海馬Aβ的表達(dá)水平,發(fā)揮了顯著作用,而TLJN對(duì)上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用不如LWDH。由此說(shuō)明,六味地黃丸可改善“腎精不足”癡呆模型動(dòng)物腦組織Aβ清除障礙,通絡(luò)救腦滴丸可改善“毒損腦絡(luò)”癡呆模型動(dòng)物腦組織Aβ清除障礙,而非對(duì)癥治療未發(fā)揮顯著改善作用,甚至還有反作用。通過(guò)以方測(cè)證,證明了SAMP8小鼠作為“腎精不足”證和雙海馬注射Aβ1-40小鼠作為“毒損腦絡(luò)”證的癡呆模型。

利益沖突聲明:無(wú)。