創傷性腦損傷合并肢體骨折后骨折愈合加速機制的研究進展

陸安靜,王庭剛,王瑞烈,楊 光,郭國寧,潘均偉,陸元蘭

遵義醫科大學附屬醫院急診科,貴州 遵義 563003

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)合并骨折是嚴重多發傷的常見類型之一,是目前重要的公共衛生問題,而TBI合并骨折患者出現骨折愈合加速的現象已在臨床中被廣泛認識。最早于20世紀60年代,由Gibson和Robert發現相較于單純肢體骨折患者,TBI合并肢體骨折患者的骨折端有大量骨痂形成,肌肉內也有異位骨化現象,證實TBI可縮短骨折愈合時間。通過骨折斷端生物力學和影像學檢查也說明了骨折合并TBI較單純骨折的骨痂密度增加,骨間隙橋接率增高,骨折愈合加速進展到重塑階段。因此闡明TBI和骨折之間的關系具有重要意義,但其具體機制仍然不明。本文就TBI導致骨折愈合加速的研究進展進行回顧分析,旨在為更加深入了解該現象背后的機制,為臨床治療骨折提供參考。

1 TBI后非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)對骨折愈合的影響

1.1微小RNA(microRNA,miRNA) miRNA是一種無編碼蛋白質功能,長18～22個核苷酸的單鏈小分子ncRNA,它可以與信使RNA(message ribonucleic acid,mRNA)上的3’非翻譯區(3’untranslated region,3’UTR)結合,降解mRNA或直接抑制其翻譯,影響細胞發育、增殖、分化和凋亡[1]。研究發現TBI合并股骨骨折患者血清及骨痂中的miRNA-26a-5p含量較單純股骨骨折患者明顯增加[2]。高表達的miRNA-26a-5p直接靶向作用于磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因mRNA的3’UTR,下調PTEN mRNA表達,通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/絲蘇氨酸蛋白激酶(serine protein kinase,AKT)信號通路,促進成骨細胞分化,加速骨折愈合[2]。另外有研究發現TBI合并股骨骨折小鼠中,miRNA-92a-3p與整合素結合唾液酸蛋白mRNA的3’UTR結合,同樣激活PI3K/AKT信號通路,導致成骨細胞特異性靶基因的轉錄表達增加[3]。B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)在多種細胞系統作為抗凋亡分子,其過表達與成骨細胞凋亡減少和成骨基因表達增加相關。細胞周期蛋白(cyclin)通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶的活性,調控成骨細胞周期的進行,促進成骨細胞增殖。而Bcl-2和細胞周期蛋白的表達下調抑制了成骨細胞分化。有研究發現TBI合并股骨骨折患者血清內miRNA-16-5p的含量明顯低于單純股骨骨折患者,體外實驗證實miRNA-16-5p的過表達顯著抑制小鼠胚胎成骨細胞前體細胞的增殖,負向調控骨折的愈合[4]。進一步研究發現miRNA-16-5p通過負向調控Bcl-2 mRNA、cyclin D1 mRNA的表達,促進成骨細胞凋亡和抑制成骨細胞增殖[4]。在TBI合并脛骨骨折患者血清中miRNA-433的表達低于單純脛骨骨折患者,分泌性磷蛋白1(secretory phosphoprotein 1,SPP1)mRNA和蛋白表達增加,SPP1可由成骨細胞分泌,并能促進成骨細胞的分化和增值[5]。證明是miRNA-433與SPP1mRNA的3’UTR結合,上調SPP1 mRNA和蛋白表達,進而影響骨折處骨痂的形成[5]。綜上,TBI合并骨折后,通過上調或下調miRNA的表達,并與下游相應靶點的3’UTR結合后調控成骨相關分子的表達,促進骨折愈合。

1.2長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA) lncRNA是一種長度超過200個核苷酸,且不能翻譯蛋白質的ncRNA。lncRNA在細胞中的定位決定它發揮怎樣的功能,在胞質中可通過與mRNA的結合來調控蛋白質的翻譯和降解;定位在細胞核中則與DNA的修飾、染色質修飾、DNA甲基化等有關。研究表明lncRNA在調節成骨細胞分化上有著關鍵的作用。Wnt/β-catenin信號通路能促進骨細胞增殖和分化、阻止細胞凋亡,還能促進成骨細胞的前體骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的分化和礦化[6]。Jiang等[7]研究發現lncRNA-抗分化非編碼RNA(lncRNA-differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,lncRNA-DANCR)通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進成骨細胞的增殖和分化。miR-138和miR-145通過靶向E盒結合鋅指蛋白2(zinc finger E-box-binding protein 2,ZEB2)抑制Wnt/β-catenin信號通路,負調控人BMSCs的成骨分化,而lncRNA-linc-ROR能直接結合于miR-138和miR-145,抑制它們的表達,進而促進BMSCs成骨分化[8]。Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)在破骨細胞和成骨細胞分化中起著至關重要的作用,還是BMSCs成骨分化的早期標志物。在家兔脛骨骨折中,通過下調lncRNA-ANCR并觸發Runx2的表達,能促進脛骨骨折愈合[9]。Guo等[10]通過對單純肢體骨折患者以及TBI合并肢體骨折患者的血清進行了lncRNA測序,共篩選出了4種高表達的lncRNA,通過構建lncRNA-細胞相互作用網絡圖,發現lncRNA可能通過調節嗜堿性粒細胞、細胞毒性T細胞、B細胞和內皮細胞的生物學行為,參與TBI加速骨折愈合,但這4種lncRNA在骨折愈合中的具體作用機制尚未闡明。綜上,lncRNA具有促成骨作用,而TBI后骨折愈合加速可能是通過lncRNA實現的。

2 TBI后信號素3A(semaphorin 3A,SEMA3A)對骨折愈合的影響

SEMA3A屬于信號素家族中的Ⅲ型分泌型蛋白,具有促進樹突分支、軸突生長和引導神經元遷移的作用,有研究發現SEMA3A在免疫系統、心血管系統及骨骼系統中有調節作用[11]。研究發現,SEMA3A可能是TBI后骨折愈合加速的重要原因。Yang等[12]證實小鼠TBI后SEMA3A的表達上調,并在第3天時達到峰值。Hayashi等[13]研究證明SEMA3A通過與其功能性受體神經氈蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)結合后,阻斷下游的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)和Ras同源基因家族蛋白A(Ras homolog gene family member A,Rho A)信號通路,抑制受體激活核因子-κ配體(receptor activator of nuclear factor κBligand,RANKL)誘導的破骨細胞分化,通過經典的Wnt/β-catenin信號通路刺激成骨細胞分化。因此SEMA3A可通過刺激成骨細胞分化并同時抑制破骨細胞分化來發揮成骨作用。由于SEMA3A及其受體也在交感神經及感覺神經元中表達,因此有研究認為SEMA3A是通過調節感覺神經在骨小梁的分布間接調節骨發育,而不是直接作用于成骨細胞[14]。此外,在脛骨骨折小鼠骨折處局部注射SEMA3A可以增加骨折處骨痂密度及體積,加速骨的重塑[15]。研究發現TBI合并脛骨骨折大鼠軟骨痂中軟骨細胞SEMA3A和NRP-1高表達,而在新生骨小梁周圍成骨細胞中低表達,推測SEMA3A/NRP-1信號系統通過影響軟骨細胞分化和增殖,而未能及時調控成骨細胞分化,是導致骨折合并TBI后軟骨痂生成較多的原因之一[16]。綜上,SEMA3A與TBI后成骨作用增強密切相關,表明SEMA3A是促進骨折愈合的潛在治療靶點。

3 TBI后神經肽對骨折愈合的影響

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一種由37個氨基酸組成的神經肽,中樞神經系統中以脊髓分布最多,大腦皮質次之。研究發現CGRP可以調節成骨細胞和破骨細胞的活性,對骨折的愈合起調節作用。用CGRP培養人成骨細胞,能上調人成骨細胞的β-catenin mRNA表達量,同時伴隨成骨標志基因表達,包括:堿性磷酸酶(alkaline phospatase,ALP)、Ⅰ型膠原、骨鈣素(osteocalcin,OC)、Runx2,進而影響成骨細胞的分化與成熟,這種上調作用能被CGRP受體拮抗劑所阻斷[17-18]。Wang等[19]將CGRP加入到體外培養的BMSCs培養液中,應用Western Blot檢測培養液中哺乳動物不育系20樣激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2)的表達,Mst1/2是Hippo通路的核心分子;又用Hippo通路抑制劑維替泊芬阻斷下游信號,結果顯示CGRP能有效促進Ⅰ型膠原、ALP、Runx2等成骨相關蛋白的mRNA表達,Mst1/2的表達水平也增加;在加入維替泊芬后成骨相關蛋白mRNA表達下降,且Mst1/2表達也受到抑制,說明CGRP能夠促進BMSCs的成骨分化,且Hippo信號通路介導了CGRP作用于小鼠BMSCs的成骨分化過程。進一步研究證實了Hippo/Yap信號通路可能參與了CGRP介導的BMSCs的遷移和成骨[19]。RANKL誘導的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的激活是破骨細胞活化和促進骨吸收的關鍵通路,CGRP可抑制該通路的表達,進而間接促進骨折愈合[20]。Xu等[21]研究發現TBI合并脛骨骨折家兔血清和腦脊液中的CGRP含量均較單純脛骨骨折明顯增加,推測TBI合并骨折并加速骨折愈合與血清中CGRP的快速增加有關。

骨折處血運重建是骨折愈合的另一個有利條件,這一過程取決于血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用,它是公認的最有力血管生成因子。Li等[22]研究發現CGRP能激活VEGF/VEGFR信號通路的下游信號分子局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),該物質參與血管內皮細胞的遷移和成熟,證實了CGRP-FAK-VEGF信號通路的成血管作用。Zhang等[23]發現TBI合并鎖骨骨折組愈傷組織中的VEGF表達明顯高于單純鎖骨骨折組,且骨折愈合時間較單純鎖骨骨折組短。

在骨折愈合過程中其他神經肽也參與其中,如血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、神經肽Y(neuropeptide-Y,NPY)、P物質(substance-P,SP)等。VIP和SP均有明顯的擴血管作用,通過調節血管的功能而加速骨折愈合。破骨細胞含有神經激肽-1受體,SP通過與神經激肽-1受體結合,激活RANK-RANKL信號通路,調節破骨細胞的骨吸收作用[24]。也有研究表明,SP能劑量依賴性地刺激成骨,低濃度SP可刺激骨髓基質細胞表達ALP、OC以及上調Runx2蛋白的表達;高濃度SP能促進骨細胞的礦化同時還能促進骨吸收,其作用強度比CGRP弱[25]。大量實驗結果均顯示中樞神經系統損傷后骨痂內神經肽分泌增加,推測可能是中樞神經系統損傷后,上行系統對周圍神經抑制減弱,使骨折處感覺神經纖維釋放神經肽增加,從而刺激骨痂和軟骨痂大量形成[26]。綜上,TBI后神經肽可通過調節成骨細胞和破骨細胞的平衡以及血管的生成來加速骨折愈合。

4 TBI后巨噬細胞對骨折愈合的影響

以往的研究認為骨的愈合只涉及成骨細胞和破骨細胞,但是目前許多研究表明免疫細胞對骨的形成、修復和重塑至關重要,成骨與破骨過程會和免疫細胞通過兩者共有的通路來相互調節,其中巨噬細胞成為骨免疫學研究的熱點。在炎癥反應中,巨噬細胞具有吞噬壞死組織和異物的功能,對促進組織愈合起重要作用。巨噬細胞分為兩種表型,促炎型(M1)和抗炎型(M2),M1巨噬細胞可分泌白細胞介素3(interleukin-3,IL-3)、IL-4、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子來促進炎癥,同時也增強了M1巨噬細胞的吞噬功能,加速壞死組織清除,但若巨噬細胞長期處于M1,會加重組織損傷[27];M2巨噬細胞分泌抗炎因子,還能促進細胞增殖、遷移、組織重塑、生長因子的分泌以及間充質干細胞介導的成骨作用[28]。Schlundt等[27]研究發現骨折愈合對巨噬細胞有獨特依賴作用,依賴于M1向M2的轉化,M1巨噬細胞可抑制成骨細胞分化,而M2巨噬細胞可表達轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和細胞介素10(interleukin-10,IL-10),抑制破骨細胞形成,支持骨沉淀;他們還發現IL-4和IL-13浸在膠原蛋白支架處,可以使截骨部位骨痂生成及骨再生能力增強,同時發現IL-4和IL-13使巨噬細胞向M2極化[27]。Zhang等[29]的研究證實了TBI合并鎖骨骨折組較單純鎖骨骨折組能加速骨折愈合,其骨痂組織的M1巨噬細胞百分比隨骨折時間延長呈下降趨勢,且該組M2巨噬細胞的百分比隨時間延長顯著高于單純鎖骨骨折組,同時伴有較大的骨痂體積,認為M2巨噬細胞可能與TBI加速骨折愈合有關。綜上,M1與M2巨噬細胞的比例可能是TBI后骨折愈合加速的因素,且早期以M1巨噬細胞為主,逐漸向M2巨噬細胞極化。

5 TBI后激素水平對骨折愈合的影響

TBI后由于內分泌應激反應,機體的激素水平會發生一系列變化,這種變化可能對骨折的愈合產生影響。研究發現TBI中血清瘦素的濃度與骨折處骨痂的體積呈正相關[30]。瘦素可以從兩個途徑影響骨的代謝過程,一是為瘦素通過調控由下丘腦控制的交感神經沖動來發揮其抑制成骨的作用,二是存在于血清中的瘦素具有促進骨礦化和成骨細胞向骨細胞分化的作用。因此TBI后下丘腦的損傷可能會導致瘦素成骨作用的去抑制,而血腦屏障的破壞使血清中瘦素濃度增加,二者協同使骨折愈合加快[31]。另外在早期TBI合并四肢骨折患者血清中,生長激素、甲狀旁腺激素水平會出現明顯升高,受傷5周后催乳素水平也會出現顯著升高,認為TBI后的這些激素變化與骨折處骨痂形成顯著相關[32]。在將TBI大鼠的血清轉移到肢體骨折大鼠體內后,發現骨折處骨痂形成增加,骨折愈合加速[33]。通過體外細胞實驗發現,與單純TBI和單純肢體骨折患者血清相比,伴有TBI的肢體骨折患者的血清對人成骨細胞增殖作用更大,推測可能是TBI后大腦產生成骨誘導因子,而血腦屏障的破壞導致成骨誘導因子被釋放入血液循環,從而在局部加速骨折愈合[34]。

6 結論與展望

骨折愈合過程復雜、連續和互相重疊,受到許多病理生理機制的調節。而肢體骨折合并TBI后成骨反應增強,骨折愈合速度加快的機制更加復雜,該結果受到ncRNA、SEMA3A、神經肽、免疫細胞和激素等因素的調節。目前研究較為局限,缺乏整體性的研究以及其中相互作用機制的探索。如何構建一個TBI加速骨折愈合的網絡機制圖,闡明各種作用機制在其中所發揮的作用,成為未來研究的關鍵問題。目前對于骨折的治療方法很多,仍有約10%的患者存在骨折愈合不良或骨不連等情況,探索加速骨折愈合的機制可為骨折尤其是骨不連的治療提供新的理論依據并作為臨床指導。

作者貢獻聲明：陸安靜:文獻收集及文章撰寫;王庭剛、王瑞烈:寫作指導;楊光:文獻收集;潘均偉:文章校對;郭國寧:寫作指導、文章修改;陸元蘭:文章設計和審校、文章修改、經費支持