響應面法優化牛膝多糖的微波法提取工藝研究

劉 佳，周亞梅，張瀟丹，李佩紋，徐冬梅

（重慶化工職業學院，重慶 401220）

中醫學包含著中華民族幾千年的康養理念和實踐經驗，是中華文明的瑰寶，凝聚著中國人民和中華民族的博大智慧。習近平總書記強調，要遵循中醫藥發展規律、傳承精華、守正創新，加快推進中醫藥現代化、產業化，堅持中西醫并重，推動中醫藥和西醫藥相互補充、協調發展，推動中醫藥事業和產業高質量發展，推動中醫藥走向世界，充分發揮中醫藥防病治病的獨特優勢和作用，為建設健康中國、實現中華民族偉大復興的中國夢貢獻力量。從國家戰略角度說明了中藥研究的重要性。

多糖為中藥有效成分之一，廣泛存在于各種動、植物和微生物組織中[1]。研究發現，多糖具有抗癌、抗腫瘤、抗衰老、抗艾滋病、降血糖、降血脂、調節免疫等作用[2]。以糖為研究重點的工程被認為是繼基因工程、蛋白質工程之后生物化學和分子生物學中最重要的研究領域。我國對中藥多糖的研究范圍涉及多糖的化學研究、藥理學研究、治療作用等，尤其在抗腫瘤方面成為一個新熱點，將多糖與核酸和蛋白質并列為生命現象中三大重要的高分子化合物。牛膝（Achyranthes bidentata Blume） 為莧科多年生草本植物的干燥根，是中國藥典收錄的常用中藥，具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行等功效[3]，有懷牛膝和川牛膝之分。懷牛膝主要分布在河南、河北等地。川牛膝主要分布在四川、云南等地。懷牛膝是“四大懷藥”之一，含有多種化學成分，包括皂苷、甾酮類、多糖類和多種微量元素[4]。懷牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP） 是其重要藥效物質基礎，在臨床應用和保健品中具有很大的開發潛力。

常見的中藥提取方法有傳統熱水浸提法、蒸汽爆破法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法等[5]。傳統熱水浸提法存在有效成分損失大、工序復雜、提取周期長、提取率低等缺點[6]。蒸汽爆破法需要高壓蒸汽，操作復雜。微波射線穿透性極好，能充分保護有效成分，對熱敏性成分的浸提極為有效[7]。相比超聲提取來說，微波提取具有選擇性好、操作簡便、提取周期短、能耗低、提取率高等特點，故微波提取在藥物成分提取中得到廣泛應用。因此，采用微波提取法對ABP 進行提取，有望減少ABP 破壞和損失，提高ABP 得率。響應曲面法（Response surface methodology，RSM） 是通過多元二次回歸方程來擬合自變量因素與響應值之間的函數關系，并利用軟件進行統計分析試驗結果，從而優化工藝參數的方法。目前已廣泛應用于中藥組分提取過程的優化中[1]。

為此，擬通過微波提取法提取ABP，并用相應面法優化微波提取工藝，確定各因素及其交互作用對ABP 得率的影響，找出整個區域上因素的最佳組合和提取率的最優值，得到最佳提取工藝條件，以提高ABP 得率。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

懷牛膝，產自河北安國市，祁澳中藥飲片有限公司提供；苯酚（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司提供；葡萄糖（分析純），天津市北辰方正試劑廠提供；濃硫酸（分析純），河北省保定化學試劑廠提供；其余試劑均為分析純。

722 型植物粉碎機、722 型分光光度計，上海青華科技儀器有限公司產品；AB204-N 型電子天平；SHZ-D 型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產品；微波爐（LG）；水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 懷牛膝多糖的微波提取

懷牛膝，干燥粉碎，過60 目篩。分別稱取1 g牛膝干粉，按照不同的料液比加蒸餾水溶解，在不同的微波條件下進行提取，然后將提取液真空抽濾、減壓濃縮并定容至100 mL。

采用傳統熱水浸提法和超聲輔助提取法做對比。稱取0.5 g 牛膝牛粉末于1 支試管中，加入15 mL 蒸餾水（即按照最佳微波提取條件的按料液比1∶30（g∶mL），在超聲功率為60 W，超聲溫度為40 ℃的條件下，超聲時間30 min，得到超聲提取液，定容后測其提取率。稱取10 g 牛膝粉末溶解在300 mL水中（按料液比1∶30 mL/g），在80 ℃的水浴鍋中浸提 8 h，得到懷牛膝的水煮提取液，測其得率。

1.2.2 多糖含量的測定及得率的計算

采用硫酸- 苯酚法測定懷牛膝可溶性總糖含量[8-9]。吸取100 μg/mL 葡萄糖標準溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 各補水至2.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，在室溫下放置20 min，于波長490 nm 處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度C（mg/mL） 為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標準曲線。

采用3,5 - 二硝基水楊酸比色法（DNS） 法測定多糖中還原糖的含量[8-9]。分別吸取10 mg/mL 的葡萄糖標準液1，2，3，4，5，6，7 mL 于10 mL 的比色管中，補蒸餾水至10 mL，即得質量濃度為1，2，3，4，5，6，7 mg/mL 的葡萄糖溶液。分別吸取上述葡萄糖溶液1 mL 于25 mL 的容量瓶中，加入3,5 -二硝基水楊酸溶液2 mL，置沸水浴中煮2 min 進行顯色，然后用流水迅速冷卻，用水定容到25 mL，搖勻，以試劑空白作參比，在最大吸收波長為540 nm處測其吸光度，并以質量濃度C（mg/mL） 為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪出標準曲線。

總糖及還原糖的含量計算方法如下公式計算：

含量（%）=

多糖含量=總糖含量- 還原糖含量[8-9].

1.2.3 單因素試驗設計

研究微波提取功率、時間、料液比和提取次數等因素對ABP 提取的影響。通過因素分析，確定其條件范圍。

1.2.4 響應面法分析試驗

在單因素試驗基礎上，選擇提取功率、提取時間、料液比及提取次數為自變量，以ABP 得率為響應值，采用Design Expert 統計分析軟件的響應面法安排試驗，根據中心組合（Box-behnken） 試驗設計原理采用四因素三水平的響應面分析法，確定微波法提取ABP 的最佳工藝參數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

采用硫酸- 苯酚法測定懷牛膝可溶性總糖含量的標準曲線為：

采用3,5 - 二硝基水楊酸比色法（DNS） 法測定多糖中還原糖的含量的標準曲線為：

標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線

2.2 單因素試驗

2.1.1 微波提取功率的影響

在料液比為1∶50，微波時間為2 min 條件下，提取1 次，比較不同微波功率ABP 得率的影響，選擇最佳功率。

不同提取參數對ABP 得率的影響見圖2。

圖2 不同提取參數對ABP 得率的影響

由圖2（a） 可知，隨微波功率的增加，ABP 得率迅速增大。但當功率超過800 W 后，ABP 得率下降。這可能是因為隨著提取功率的增加，提取率提高，但提取功率更大以后，產生的多糖會被降解和氧化。所以確定ABP 的最佳微波功率為800 W。微波提取功率對ABP 的提取率有顯著的影響。

2.1.2 微波提取時間的影響

固定料液比為1∶50，提取功率為800 W，提取1 次，比較不同微波提取時間對ABP 得率的影響，選擇最佳微波提取時間。由圖2（b） 可知，隨微波提取時間的增加，ABP 得率迅速增大。但超過2.5 min 后，ABP 得率下降。這可能是因為隨著提取時間的增加，細胞被均勻破壞，并加速了ABP 在水中的釋放和擴散。但提取時間更長以后，產生的ABP會被降解或氧化。所以確定ABP 的最佳提取時間為2.5 min。微波提取時間對ABP 的提取有顯著影響。

2.1.3 料液比的影響

固定提取時間2.5 min 及功率800 W 條件下，選擇料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL） 各提取1 次，根據ABP 得率確定最佳料液比。由圖2（c） 可知，隨著料液比的增加，ABP 得率增大，但超過料液比超過1∶30（g∶mL） 之后，ABP 得率下降。這可能是因為較大的料液比中多糖從內部細胞擴散至外部溶劑的速率更快，料液比更大以后，附著在單位體積上的微波能量會降低，導致提取率降低。所以，確定提取ABP 的最佳料液比為1∶30（g∶mL）。

2.1.4 提取次數的影響

在固定上述各因素最佳條件下，測定提取1 次的ABP 得率，再將抽濾所得的沉淀全部轉移至1 個燒杯中，重復以上操作。依次測得提取2，3 次樣品中多糖含量，記錄結果，得出最佳提取次數。由圖2（d） 可知，隨著提取次數的增加，ABP 得率增大，但當提取次數達到2 次之后，ABP 得率增加的趨勢有所平緩。考慮到節約資源和能源，選擇ABP 最佳提取次數為2 次。

2.2 響應面分析法試驗

2.2.1 微波法提取牛膝多糖響應面試驗設計因素水平及編碼

微波法提取懷牛膝多糖響應面試驗設計因素與水平設計見表1。

表1 微波法提取懷牛膝多糖響應面試驗設計因素與水平設計

2.2.2 微波法提取牛膝多糖響應面試驗設計及結果

微波法提取懷牛膝多糖響應面試驗設計及結果見表2。

表2 微波法提取懷牛膝多糖響應面試驗設計及結果

由表2 可知，利用Minitab 軟件對表2 中的試驗數據進行多元回歸擬合，以A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1 為自變量，以多糖產率為響應值（Y），進行響應面分析試驗。得到牛膝多糖提取率對編碼自變量的二次多項式回歸模型為：

Y=29.37-0.83A-0.18B+0.39C-0.31D-0.81AB+0.000AC+1.07AD+1.22BC-1.5BD-2.83CD-3.54A2-3.66B2-4.22C2-5.52D2.

對多元二次回歸方程取一階偏導得零，得到A=-0.127 8，B=0.013 1，C=0.068 1，D=-0.059 7 代入A=(a-800)/200，B=(b-2.5)/0.5，C=(c-30)/10，D=(d-2)/1，得a=774，b=2.5，c=31，d=2。為檢驗Boxbehnken 試驗設計所得結果的可靠性，將上述優化出的工藝參數修正為微波功率800 W，提取時間2.5 min，料液比1∶30（g∶mL），提取次數2 次。回歸方程的R2=0.869 3，相關系數R=0.932 3，說明模型響應值的變化93.23%來自所選參考變量。因此，回歸方程可較好地描述因子與響應值之間的關系。

回歸模型顯著性檢驗及方差分析見表3。

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

由表3 可知，試驗因子與響應值不是簡單的線性關系。整體模型的p<0.01，表明該二次方程模型具有高度顯著性，可以較好地描述各因素與響應值之間的關系，能夠擬合真實的試驗結果。各因素對多糖產率的影響是A>C>D>B，即功率影響最大，其次是料液比、提取次數、提取時間。

2.2.3 微波法提取牛膝糖響應曲面直觀分析

微波功率、提取時間、料液比、提取次數對ABP 產率的交互影響曲面圖見圖3。

圖3 提取功率、提取時間、料液比、提取次數對ABP 產率的交互影響曲面圖

圖3 是通過多元回歸方程所做的響應曲面圖及等高線圖，所擬合的響應曲面及等高線圖能比較直觀地反映各因素和各因素間的交互作用。由圖3 可知，6 個響應曲面均為開口向下的凸型曲面，同時等高線最小橢圓的中心在所選的范圍內，說明響應值（牛膝多糖提取率） 在4 個因子設計的范圍內存在最大值。比較幾個圖可以看出微波功率（A） 對響應值的影響比較大，表現為Y 值的變化比較大。圖3（e） 表明B、D 的交互作用顯著，在所選范圍內，B取不同的編碼值時D 對Y 的影響表現出不同的規律，同樣D 取不同的編碼值時B 對Y 的影響規律也呈一定的變化趨勢。從單個因素對Y 值的影響來看，D的影響顯著性要大于B。圖3（f） 表明C、D 的交互作用最顯著，在所選范圍內，C 取不同的編碼值時D對Y 的影響表現出不同的規律，同樣D 取不同的編碼值時C 對Y 的影響規律也呈一定的變化趨勢。從單個因素對Y 值的影響來看，C 的影響顯著性要大于D。由圖3（a） 可以看出A 與B 的交互作用并不顯著，它們對Y 值的影響規律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。同時也可以看出A 對Y 值影響的顯著性要大于B。圖3（b） ~ 3（d） 也表現出與圖3（a） 相似的規律。綜合各圖，4 個因素對Y值的影響，以及各因素之間的交互影響與回歸分析結果吻合。

2.2.4 驗證試驗

在響應面方法優化得到的最佳條件下對牛膝進行3 次平行微波提取試驗，平均產率為29.40%，與理論預測值29.38%相比，相對誤差為0.07%，驗證值與回歸方程所預測值相吻合得很好，驗證了此模型的可行性。

2.3 提取方法對牛膝多糖產率的影響

擬合模型獲得的試驗結果與常規方法的試驗結果比較見表4。

表4 擬合模型獲得的試驗結果與常規方法的試驗結果比較

由表4 可知，ABP 產率為微波提取> 超聲提取>熱水浸提法，微波輔助提取遠遠優于常規熱水浸提法，也明顯優于超聲輔助提取。這些結果表明微波提取懷牛膝多糖的優越性。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平的Box-behnken 中心組合設計試驗，采用多元二次回歸模型對各項進行統計分析，得最優的條件為微波功率800 W，提取時間2.5 min，料液比為1∶30（g∶mL），提取次數為2 次，牛膝總多糖提取率的理論值為29.38%。按最優條件進行驗證試驗，牛膝多糖的產率為29.40%，與理論值的相對誤差為0.07%，對工業提取牛膝多糖有一定的指導意義。試驗結果表明，采用微波提取工藝提取牛膝中的多糖提取率優于超聲提取法、常規熱水浸提工藝，微波輔助法適用于提取ABP。