中西藥聯用對禽致病性大腸桿菌病的治療作用

吳逸琳，蘇海倫，姚潤藝，王帥琪，張占麗，左 麗*，張永英

（ 1． 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000 ；2． 館陶縣農業農村局，河北 邯鄲 057150 ）

近年來，多重耐藥大腸桿菌的出現和廣泛傳播給疾病治療帶來了巨大困難[1]，使抗菌藥物的治療效果越來越差。禽致病性大腸桿菌病的治療尤為困難，傳統的抗生素療法效果甚微[2-3]。因此研究人員將重點放在尋找新的治療方法。研究表明，中藥具有多靶點、無毒副作用等優點[4]，用于治療細菌性疾病具有良好的效果。但一種中藥含有多種有效成分，成分及藥效受到產地、炮制方式等多種因素的影響，限制其在臨床中的應用[5]。中藥有效成分具有多靶位效應，對于不同耐藥機制介導的大腸桿菌耐藥性具有消除效果[6]，更具有實際應用價值。本研究利用中藥有效成分形成組合物，并對禽致病性大腸桿菌病進行治療，為其臨床治療多重耐藥大腸桿菌病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

血清型為O78 的禽致病性大腸桿菌由河北工程大學禽病工程技術研究中心保存[7]。檸檬酸、蘆丁、小檗堿、頭孢噻肟等標準品購自北京索萊寶科技有限公司。三黃湯購自邯鄲市同仁堂藥店。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

頭孢噻肟、檸檬酸溶解于100 mL無菌蒸餾水中，蘆丁和小檗堿溶解于100 mL 10% DMSO中，0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.2.2 中藥有效成分對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）測定

將大腸桿菌純化后采用二倍稀釋法測定各中藥有效成分MIC。在96 孔板中將各中藥有效成分2 倍倍比稀釋為10個稀釋度，1～10孔依次加入濃度為1×106CFU/mL菌液100 μL。第11 孔加入100 μL 菌液為陽性對照組，第12 孔加入100 μL LB 為陰性對照組，每組3 個重復，37 ℃培養24 h后觀察結果，以無菌生長的最低稀釋度定為該菌的MIC值。

1.2.3 亞抑菌濃度（1/2 MIC）組合物處理

大腸桿菌接種于LB 液體培養基，37 ℃、180 r/min 搖床培養4.0～4.5 h，比濁儀調整菌液濃度至1×106CFU/mL，然后加入終濃度為1/2 MIC 的中藥組合物（檸檬酸、蘆丁、小檗堿按2∶1∶2 體積比組合），37 ℃、180 r/min 搖床培養18～24 h，重復以上步驟連續作用72 h。

1.2.4 大腸桿菌動物模型建立

選擇1 日齡蛋雛雞75 只，適應性飼養6 d，7 日齡時用血清型為O78 且對頭孢噻肟耐藥的雞源大腸桿菌攻毒。記錄48 h 內死亡率，按照改良寇氏法計算半數致死量（LD50）。大腸桿菌動物模型試驗設計見表1。

表1 大腸桿菌動物模型試驗設計Tab.1 Grouping of E. coli animal models

1.2.5 動物回歸試驗細菌分離鑒定

剖檢攻毒后的蛋雛雞，無菌操作從病變臟器中分離細菌，進行生化試驗，確定細菌種屬，通過玻片凝集試驗鑒定血清型，檢測分離菌株和攻毒菌株是否一致。

1.2.6 組合物治療試驗

選擇1 日齡蛋雛雞180 只，隨機分成6 組（試驗設計見表2），適應性飼養6 d。7 日齡時，使用濃度為1.102×108CFU/mL O78 型大腸桿菌攻毒。從攻毒時開始采用飲水給藥的治療方式；針對臨床癥狀嚴重、不能正常飲水的雞進行人工灌服，劑量為20 mL/kg，2次/d。記錄各組雞的發病情況，統計治愈率、有效率、死亡率。

表2 組合物治療試驗設計Tab.2 Composition treatment trial groups

2 結果與分析

2.1 中藥有效成分對O78大腸桿菌的MIC（見圖1）

圖1 中藥有效成分對O78大腸桿菌的MICFig.1 MIC of active components of traditional Chinese medicine against Escherichia coli O78

由圖1可知，小檗堿、檸檬酸、蘆丁對大腸桿菌的MIC為2.00、6.25、8.00 g/L，小檗堿的抑菌效果最好。DMSO作為溶劑對照組對大腸桿菌MIC為25%，而本試驗中DMSO作為溶劑所用濃度為10%，因此對本試驗結果無影響。

2.2 大腸桿菌最佳攻毒劑量確定（見表3）

表3 大腸桿菌最佳攻毒劑量確定Tab.3 Determination of optimal Challenge dose of E. coli 單位:只

由表3 可知，根據改良寇氏法得出大腸桿菌O78 對蛋雛雞LD50=1.102×108CFU/mL。即1.102×108CFU/mL、0.5 mL為最佳的攻毒劑量。

2.3 動物回歸試驗（見圖2、表4）

圖2 動物回歸試驗結果Fig.2 Result of animal regression test

表4 大腸桿菌生化試驗結果Tab.4 Biochemical reactions of E. coli

由圖2可知，患病蛋雛雞剖檢可見心臟、肝臟表面有黃色纖維素性滲出物，包膜肥厚易剝離，與周圍組織粘連。將上述病料無菌接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養24 h，形成中等大小、突起的粉紅色菌落；挑取病料顯微鏡觀察下可見粉紅色的革蘭氏陰性短桿菌。

由表4可知，生化反應試驗結果顯示，分離株與大腸桿菌接近度為99.8%。測序后經序列比對同源性在99.9%以上，表明分離株為大腸桿菌。玻片凝集試驗出現明顯凝集現象，說明分離株與攻毒菌株為同一菌株，大腸桿菌致病模型建立成功。

2.4 中藥組合物治療雞大腸桿菌病的效果（見表5）

表5 中藥組合物治療雞大腸桿菌病的效果Tab.5 Clinical therapeutic effect of the composition on chicken colibacillosis

由表5 可知，中藥組合物與頭孢噻肟聯合使用可增強頭孢噻肟對大腸桿菌的治療作用，且優于頭孢噻肟單獨治療效果。陽性對照組雞群治愈率為60.0%、有效率為72.0%、死亡率為16.7%；試驗組雞群治愈率達86.7%、有效率為93.3%、死亡率僅為6.7%。綜上所述，組合物與頭孢噻肟聯合應用可增強頭孢噻肟對大腸桿菌的治療作用。

3 討論

隨著養殖業的快速發展，采用集約化養殖的雞場養殖數量不斷擴大，飼養密度持續增大，易發多種疾病。雞大腸桿菌病作為規模化雞場常發疾病之一，嚴重危害雞的生長發育[8]。禽大腸桿菌病常與血清型為O1、O2、O5、O8、O18和O78等大腸桿菌相關[9]。雞群各個年齡段均易感大腸桿菌病，其中成年雞群感染率最高（36.73%）。雞大腸桿菌病治療多依賴抗生素，但隨著多重耐藥大腸桿菌分離株增多，導致抗生素對這類疾病的治療效果不佳。APEC 菌株可表達對超廣譜β-內酰胺類抗生素耐藥的基因，從而降低頭孢噻肟的藥效，因此頭孢噻肟在家禽養殖和孵化場的應用有限[10]。治療雞大腸桿菌病方式有多種，如抗生素、噬菌體、中藥等，但使用抗生素時，雖然可輔助宿主防御、控制和消除感染，但也可引起毒性或過敏反應，并與耐藥菌發生重疊感染，促進微生物染色體突變產生耐藥性，隨后耐藥基因向易感物種轉移，進一步促進耐藥基因的表達[5]。而我國傳統中藥治療細菌感染時不易產生耐藥性，對機體的毒性作用較小，且組方中藥具有多靶點優勢[4,11]，根據不同耐藥機制篩選中藥進行組方治療，可降低大腸桿菌耐藥性，提高雞大腸桿菌病治愈率[7]。賀常亮等[12]表明，用香芪湯組方治療經大腸桿菌O78攻毒雞群，高劑量組對患病雞群的有效率（86.7%）顯著高于中劑量組（80%）和低劑量組（60%）；并且高劑量組心包炎和肝周炎發病率分別為66.7%和40.0%，顯著低于攻毒對照組、低劑量組。于文會等[13]表明，黃連組方對大腸桿菌O78 具有抑制作用，其MIC 為62.5 g/L、菌株死亡率為74.1%，顯著高于正常組菌株死亡率（37.2%）；中劑量組對發病雛雞治療效果顯著，治愈率為86.67%，明顯高于西藥組（治愈率60%）。曹翠萍[14]研究表明，黃芩+阿米卡星組方對患有雞大腸桿菌病的雞群治愈率（76.6%）和保護率（83.3%），均高于阿米卡星對照組（治愈率43.3%、保護率53.3%）和感染對照組（治愈率3.3%、保護率16.7%）。申海龍[15]研究表明，采用中藥、西藥、中西藥組合治療某雞場發病雞，中藥組治愈率50%，西藥組治愈率60%，中西藥組合組治愈率80%，中西藥聯合使用可以有效增加疾病治愈率。上述研究結果表明，中藥組方治療雞大腸桿菌病具有較好的效果，且中西藥聯合應用可提高疾病治愈率，但目前對中藥有效成分和頭孢噻肟聯用治療禽大腸桿菌病的報道較少，本研究利用中藥有效成分組合物與頭孢噻肟聯合治療禽大腸桿菌病，避免了中藥的缺點，同時還繼承了其多靶點的優點，比傳統中藥的治療效果更佳。

4 結論

本試驗結果顯示，由檸檬酸、蘆丁、小檗堿組成的中藥組合物和頭孢噻肟聯合應用治療禽大腸桿菌病的有效率高達93.3%，高于傳統組方三黃湯治療組（80.0%），表明該組合物可應用于治療禽大腸桿菌病。中藥藥效因多種因素影響導致臨床應用受到限制，中藥有效成分組合物具有多靶點、不易產生耐藥性的優點，更便于臨床上推廣應用，并且與頭孢噻肟聯用對禽大腸桿菌病的有效率高達93.3%，為臨床中大腸桿菌病的治療及用藥提供新思路。