幾種食用菌胞外降解酶的研究進(jìn)展

王靜蕾,祝國(guó)強(qiáng),陳毅凡,王紅艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺(tái)研究院,山東 煙臺(tái) 264670)

0 引言

近年來(lái),我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,產(chǎn)量由1978年的5.8 萬(wàn)t提高至2020年的4 016.43萬(wàn)t,已成為我國(guó)繼糧、油、蔬、果后的第5大種植業(yè)[1]。食用菌屬異養(yǎng)型生物,營(yíng)腐生或寄生生活,生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中依靠自身分泌的胞外酶分解外界的有機(jī)物而獲得營(yíng)養(yǎng)。野生食用菌多以腐木和腐葉等作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,人工栽培的食用菌多以木屑、棉籽殼、秸稈和麥麩[2]等作為栽培基質(zhì),其中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和淀粉等天然高聚物質(zhì),可誘導(dǎo)食用菌分泌纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶和淀粉酶等多種胞外降解酶,在胞外酶的作用下對(duì)外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解進(jìn)而獲得碳源和氮源[3]。因此,胞外降解酶在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,胞外酶活力的高低直接決定食用菌對(duì)培養(yǎng)基料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解速率,影響食用菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用速率,進(jìn)一步影響食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)。食用菌胞外酶的合成分泌主要受基因的控制,同時(shí)也受外界環(huán)境和自身代謝等因素的影響,因此,不同生長(zhǎng)時(shí)期食用菌合成分泌的胞外酶種類(lèi)和活力不盡相同。食用菌胞外降解酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、淀粉酶、果膠酶和蛋白酶等,可分解基質(zhì)中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、多糖和蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì),為食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)保障[4]。目前,關(guān)于食用菌胞外降解酶的種類(lèi)、活性測(cè)定方法及其應(yīng)用等已有大量的研究報(bào)道。為我國(guó)食用菌胞外降解酶的研究與應(yīng)用提供參考,從食用菌的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶和淀粉酶4種主要胞外酶的研究概況、測(cè)定方法和應(yīng)用研究等方面進(jìn)行概述。

1 食用菌胞外酶的種類(lèi)

1.1 纖維素酶系

食用菌纖維素酶是降解纖維素生成短鏈葡聚糖、寡糖或葡萄糖的一組酶系,根據(jù)催化反應(yīng)功能的不同分為內(nèi)切葡聚糖酶(C1酶)、外切葡聚糖酶(Cx酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL酶)。纖維素本身不溶于水,纖維素酶與纖維素難以形成酶-底物復(fù)合物(ES),因此需要借助纖維素酶的吸附作用形成復(fù)合物,在多種酶組分的協(xié)同作用下分解利用纖維素,為食用菌的生長(zhǎng)提供碳源[4]。目前,有關(guān)食用菌胞外纖維素酶的研究多集中于不同食用菌品種的產(chǎn)纖維素酶能力、纖維素酶的篩選與鑒定和纖維素酶的活力提升方法等方面。丁玉萍等[5]研究表明,大白菇、金針菇、香菇、竹蓀、磷蓋紅菇和杏鮑菇6種食用菌的產(chǎn)纖維素酶能力以磷蓋紅菇最強(qiáng)。DEBNATH等[6]通過(guò)控制物理和化學(xué)參數(shù)影響野生食用菌Pleurotusgiganteus胞外纖維素酶的活性,篩選出胞外纖維素酶活性最適條件為溫度50 ℃、pH 5.0、底物濃度1.4%(羧甲基纖維素)和反應(yīng)時(shí)間30 min。馮光志等[7]研究發(fā)現(xiàn),鋅能促進(jìn)平菇胞外酶的分泌。

1.2 半纖維素酶系

食用菌半纖維素酶簡(jiǎn)稱(chēng)HC酶,為β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和α-葡萄糖醛酸酶等酶協(xié)同作用下而形成的酶系,能將半纖維素降解為木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等單糖供菌絲體吸收利用。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶是水解半纖維素的關(guān)鍵酶,木聚糖酶將木聚糖水解為低聚木糖,降低聚合度,木糖苷酶通過(guò)水解木寡糖的末端催化木糖殘基的釋放[8]。目前,有關(guān)食用菌胞外半纖維素酶的研究多集中于半纖維素酶活性方面,包括產(chǎn)酶能力以及產(chǎn)酶條件優(yōu)化等。張紅剛等[9]研究發(fā)現(xiàn),在菌絲體階段和現(xiàn)蕾前期噴施三十烷醇、3-吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸和蕓苔素內(nèi)酯6種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)后白靈菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段半纖維素酶活性均有所提高,其中蕓苔素內(nèi)酯對(duì)半纖維素酶的影響最大。JURAK等[10]對(duì)從菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體形成階段的雙孢蘑菇堆肥中提取的內(nèi)切木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡聚糖酶的活性分析表明,4種酶均存在內(nèi)切木聚糖酶和β-木聚糖酶的活性,以葡聚糖酶活性較小。張孔金等[11]研究富硒巴西蘑菇菌絲胞外酶活性發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的硒對(duì)半纖維素酶活性具有促進(jìn)作用。

1.3 木質(zhì)素降解酶系

食用菌木質(zhì)素降解酶主要包括過(guò)氧化物酶(LiP)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)和漆酶(LaC)。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶是木質(zhì)素降解過(guò)程中的主要酶類(lèi),可在木質(zhì)素聚合物內(nèi)形成自由基,導(dǎo)致化學(xué)鍵穩(wěn)定性變差從而破壞木質(zhì)素大分子。錳過(guò)氧化物酶和漆酶同屬于酚氧化酶。目前,有關(guān)食用菌胞外木質(zhì)素降解酶的研究已有大量報(bào)道,其中漆酶研究開(kāi)展較早,是所有木質(zhì)素降解酶中研究最多的酶類(lèi),過(guò)氧化物酶也有學(xué)者進(jìn)行一定的研究。李鵬等[12]采用雙因素方差分析3個(gè)毛木耳菌株在木屑、玉米芯、棉籽殼和麥麩4種栽培基質(zhì)下的產(chǎn)漆酶活性發(fā)現(xiàn),毛木耳菌株中毛木耳781和玉木耳01分泌的漆酶活性最高,栽培基質(zhì)中麥麩對(duì)毛木耳菌株產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)。張初署等[13]研究表明,食用菌SJ-1漆酶的最適反應(yīng)pH為3.0,最適反應(yīng)溫度為35 ℃;Cu2+能夠顯著激活食用菌SJ-1漆酶的活性,而 Fe2+、Ca2+、Mg2+、Na+和K+對(duì)SJ-1漆酶活性具有不同程度的抑制作用。肖冬來(lái)等[14]研究發(fā)現(xiàn),常見(jiàn)金屬離子Ca2+、K+、Mn2+、Mg2+和Fe2+等對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性具有抑制作用,Na+對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性具有促進(jìn)作用。

1.4 淀粉酶系

食用菌淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶的總稱(chēng),能夠分解淀粉糖苷鍵。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉和糖元等α-1,4-葡聚糖的α-1,4-糖苷鍵,水解生成葡萄糖、麥芽糖和含有α-1,6-糖苷鍵支鏈的糊精。目前,食用菌胞外淀粉酶的研究主要集中在活性方面,主要是探究不同條件變量下的淀粉酶活性。閆靜等[15]對(duì)不同溫度下秀珍菇胞外淀粉酶活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),相同處理溫度下,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),淀粉酶活性總體呈先升后降趨勢(shì)。肇瑩等[16]研究小麥、大米和柞蠶蛹3種栽培基質(zhì)下蛹蟲(chóng)草胞外淀粉酶的活性及其與營(yíng)養(yǎng)成分的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),小麥、柞蠶蛹和大米3種栽培基質(zhì)胞外淀粉酶活性依次遞減,且蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蛋白質(zhì)的累積與淀粉酶活性呈極顯著正相關(guān)。BEDADE等[17]在不同的碳源、pH和培養(yǎng)時(shí)間條件下對(duì)斑塊塊菌菌絲體進(jìn)行液體深層發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的最優(yōu)條件為可溶性淀粉0.5% (w/v)、初始培養(yǎng)基pH 7.0和培養(yǎng)時(shí)間7 d,該條件下淀粉酶活力達(dá)1.41 U/mL,且該淀粉酶在pH 5.0和50 ℃時(shí)活性最強(qiáng)。

2 食用菌胞外酶活性的測(cè)定方法

2.1 定性分析

平板顯色法是定性分析食用菌胞外酶活性的主要方法,具有顯色快捷和操作簡(jiǎn)易特點(diǎn),常用于從大量食用菌菌株中篩選產(chǎn)目標(biāo)胞外酶的菌株,可為多種食用菌的產(chǎn)酶菌株篩選減少篩選工作量。平板顯色法包括平板透明圈法和平板變色圈法,透明圈和變色圈的出現(xiàn)速度、直徑大小以及變色圈的顏色深淺能夠直接反映菌株與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或指示劑等物質(zhì)反應(yīng)的能力,可初步判斷菌株生成的胞外酶數(shù)量及活性[18]。平板透明圈法是指在固體栽培基質(zhì)中加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使試驗(yàn)菌株生成的特定胞外酶分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在菌落周?chē)a(chǎn)生透明圈[19]。如定性篩選產(chǎn)纖維素酶常用剛果紅選擇培養(yǎng)基,其原理是剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素(多糖)形成紅色復(fù)合物,但剛果紅并不與水解后的葡萄糖和纖維二糖形成復(fù)合物,培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。徐源等[20]利用剛果紅染色法對(duì)生產(chǎn)中常見(jiàn)的6個(gè)食用菌菌種進(jìn)行高活性纖維素酶菌株篩選發(fā)現(xiàn),雞腿菇51的纖維素酶降解能力最強(qiáng),平菇各品種其次,茶樹(shù)菇TS1最弱。定性分析產(chǎn)半纖維素酶也常使用平板透明圈法,在培養(yǎng)基中添加木聚糖并用染色劑染色,木聚糖酶水解木聚糖后出現(xiàn)染色區(qū)和透明區(qū),透明圈直徑與酶量的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)[21]。此外,定性篩選淀粉酶時(shí),在含有淀粉的培養(yǎng)基中噴灑含碘染色劑,被染色的藍(lán)色平板上會(huì)出現(xiàn)以產(chǎn)淀粉酶菌種為中心的透明圈。平板變色圈法是指在固體栽培基質(zhì)中加入特定指示劑,使得實(shí)驗(yàn)菌株生成的胞外酶與指示劑發(fā)生顯色反應(yīng)[19]。如定性分析食用菌木質(zhì)素酶主要采用平板變色圈法,漆酶(LaC)能使單寧酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚镔|(zhì),錳過(guò)氧化物酶(MnP)和Mn2+共同作用將愈創(chuàng)木酚氧化成棕紅色有機(jī)物,木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)能使RB-亮藍(lán)變?yōu)辄S色,通過(guò)平板的變色情況定性分析菌株產(chǎn)木質(zhì)素酶能力。高鋒等[22]通過(guò)平板變色圈法,分別利用RB-亮藍(lán)、單寧酸和愈創(chuàng)木酚為底物的培養(yǎng)基測(cè)定平菇、香菇和杏鮑菇中的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、漆酶和錳過(guò)氧化物酶。

2.2 定量分析

2.2.1 纖維素酶活性 纖維素酶是復(fù)合酶,其定量分析方法可分為單一纖維素酶組分酶活力測(cè)定和纖維素酶總酶活力測(cè)定。單一纖維素酶組分活力測(cè)定的方法主要是羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測(cè)定方法[23],纖維素酶作用于CMC-Na并將其分解為葡萄糖和纖維二糖等還原糖,DNS與還原糖反應(yīng)生成紅棕色化合物,以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制還原糖濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)液顏色強(qiáng)度與還原糖含量成比例,利用比色法得到還原糖濃度,從而確定酶活力。

馮作山等[24]報(bào)道,白靈側(cè)耳栽培過(guò)程中各生長(zhǎng)發(fā)育階段的羧甲基纖維素酶活性,以實(shí)體生長(zhǎng)階段第107 天時(shí)達(dá)最大值。纖維素酶總酶活力測(cè)定方法主要是濾紙酶活(FPA)測(cè)定方法,濾紙是聚合度中等的纖維素材料,纖維素酶將其水解后生成的還原糖量的多少反應(yīng)酶活高低,通過(guò)加DNS試劑顯色后的OD值得出具體酶活數(shù)值,該方法由于濾紙結(jié)構(gòu)復(fù)雜,一般適用于酶活力較強(qiáng)的菌株[25]。趙長(zhǎng)江等[26]采用羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測(cè)定方法和濾紙酶活測(cè)定方法分別測(cè)定不同碳、氮源對(duì)猴頭菌的單一纖維素酶活性和總酶活性得出,葡萄糖碳源和蛋白胨氮源下單一纖維素酶活性最強(qiáng),葡萄糖碳源和苯丙氨酸氮源下總酶活性最強(qiáng)。此外,熒光定糖法也可用于酶活力的測(cè)定[23],該法利用纖維素水解產(chǎn)物還原糖與反應(yīng)液反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度來(lái)表征酶活力,且其反應(yīng)靈敏、迅速,適于較低酶濃度的測(cè)定。

2.2.2 半纖維素酶 半纖維素酶主要包括木聚糖酶和木糖苷酶。木聚糖酶和木糖苷酶的活性均采用分光光度計(jì)法測(cè)定,但顯色原理有所不同。木聚糖酶的顯色原理是木聚糖酶分解木聚糖生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)發(fā)生顯色反應(yīng)。而木糖苷酶的原理是利用硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)與木糖苷酶反應(yīng)產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚(pPN)與Na2CO3反應(yīng)顯色[8]。馬懷良等[27]采用DNS顯色法測(cè)定猴頭菌糠、平菇菌糠和滑子蘑菌糠中的木聚糖酶在不同pH和溫度條件下的活性。林金盛等[28]采用pNPX測(cè)定了不同濃度MgSO4下草菇在含檸檬酸鈉的PDB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的木糖苷酶活性。

2.2.3 木質(zhì)素降解酶 木質(zhì)素降解酶活性的測(cè)定方法主要有分光光度計(jì)法、脈沖激光光聲分析法、高效液相色譜法和極譜法等,主要用于漆酶、過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶活性的定量分析。其中,分光光度計(jì)法具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定迅速和儀器設(shè)備簡(jiǎn)易等特點(diǎn),在木質(zhì)素降解酶活性測(cè)定中應(yīng)用較多,根據(jù)所測(cè)酶的種類(lèi)不同選擇不同的底物和緩沖溶液。測(cè)量漆酶活性常見(jiàn)的分光光度計(jì)法有ABTS法和愈創(chuàng)木酚法等,不同方法優(yōu)缺點(diǎn)各異。ABTS法以ABTS作為底物,優(yōu)點(diǎn)是漆酶對(duì)ABTS親和力高,反應(yīng)靈敏,但ABTS價(jià)格較高。愈創(chuàng)木酚法以愈創(chuàng)木酚為底物,價(jià)格較低但反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定,酶活數(shù)值偏低,且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)[19]。測(cè)量木質(zhì)素錳過(guò)氧化物酶(MnP)酶活常采用愈創(chuàng)木酚法,MnP和Mn2+共同作用于愈創(chuàng)木酚可使其變?yōu)樽丶t色,根據(jù)其吸光度不同測(cè)定其酶活;木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)酶活的測(cè)定常采用藜蘆醇氧化速率法,以藜蘆醇為底物,H2O2進(jìn)行催化,測(cè)得310 nm下的吸光度值判斷LiP的酶活。郭艷艷等[29]利用ABTS、愈創(chuàng)木酚和藜蘆醇分別測(cè)定不同營(yíng)養(yǎng)條件下斑玉蕈胞外漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性。張仕琦等[30]采用ABTS法和Mn2+混合溶液,通過(guò)分光光度計(jì)法測(cè)定阿魏側(cè)耳NB-1菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的胞外漆酶和錳過(guò)氧化物酶活性,以優(yōu)化產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的培養(yǎng)基。

2.2.4 淀粉酶活性 分光光度計(jì)法是淀粉酶活性定量分析最常用的方法,可分為碘-淀粉比色法和DNS法。碘-淀粉比色法原理為α-淀粉酶催化水解淀粉,碘液與反應(yīng)后未被水解的底物淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物[31]。淀粉酶DNS法與纖維素酶DNS法原理相同,具有試劑易得和測(cè)定準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。楊光等[32]采用碘-淀粉比色法測(cè)定微量直鏈淀粉含量,其具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和快速等特點(diǎn)。范博文等[31]利用DNS法測(cè)定不同碳、氮源對(duì)猴頭菌胞外淀粉酶活性,并將生長(zhǎng)指標(biāo)與淀粉酶活性聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),淀粉酶活性與液體培養(yǎng)菌絲干質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 食用菌胞外酶的應(yīng)用

目前,微生物來(lái)源的纖維素酶和半纖維酶已經(jīng)在食品加工、乙醇發(fā)酵生產(chǎn)、飼料加工和環(huán)境治理等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,而食用菌來(lái)源的纖維素酶和半纖維酶的應(yīng)用研究較少且不夠深入,主要用于菌種活力的鑒定、栽培基質(zhì)的篩選和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢物的轉(zhuǎn)化再利用等。楊勇[33]研究發(fā)現(xiàn),食用菌胞外酶中的纖維素酶可作為降解刺梨果渣的主要催化劑,以提高刺梨果渣的利用率并解決刺梨果渣帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題;徐瑞蔓等[34]報(bào)道,食用菌菌糠中含有大量微生物和纖維素半纖維酶,可加快牛糞堆肥的腐熟進(jìn)程。食用菌木質(zhì)素降解酶除在菌種培養(yǎng)和栽培中具有重要作用外,在食品安全、工業(yè)染料處理和抗腫瘤藥物等方面也有研究報(bào)道。婁海偉等[35]篩選出食用菌漆酶用以降解黃曲霉毒素B1(AFB1),每年可減少大量谷物因被黃曲霉毒素B1污染而造成的損失;楊建明等[36]從毛木耳粗酶液中分離純化得到Lac A、Lac B和Lac C 3種漆酶,其中Lac B對(duì)RB亮藍(lán)得脫色率達(dá)77.4%。馬茜茜等[37]從云芝發(fā)酵液中純化得到1種漆酶,其對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞和肝癌HePG2細(xì)胞均有抑制作用。淀粉酶在以淀粉為原材料的工業(yè)中發(fā)揮著重要作用,包括淀粉深加工行業(yè)、洗滌劑業(yè)、紡織業(yè)、烘焙食品以及生物燃料等[38]。目前,商品化淀粉酶主要通過(guò)微生物發(fā)酵法制備,鮮見(jiàn)食用菌淀粉酶制備及應(yīng)用的研究報(bào)道。

4 展望

食用菌胞外酶種類(lèi)豐富,在食用菌的營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。因此,對(duì)食用菌胞外酶的作用機(jī)理、生物學(xué)性質(zhì)和實(shí)際應(yīng)用等進(jìn)行研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前,有關(guān)食用菌胞外酶的研究多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,僅有漆酶等少數(shù)胞外酶的研究較為深入。我國(guó)食用菌資源豐富,其蘊(yùn)藏的胞外酶及其酶基因具有重要的開(kāi)發(fā)前景。今后可利用高通量篩選技術(shù)獲得胞外酶活性較高的食用菌菌株,開(kāi)展對(duì)其產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)和編碼基因等方面的研究。一方面,通過(guò)發(fā)酵技術(shù)制備食用菌胞外酶;另一方面,可克隆其胞外酶基因,利用酶分子的定向進(jìn)化技術(shù)和基因工程手段對(duì)其進(jìn)行改造與生產(chǎn),使其更適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。