千日菊提取物的護膚功效研究

張澤華 陳晨 嚴明強

千日菊作為一種分布廣泛的植物，在食品、醫藥等領域有諸多應用研究，目前很少在護膚品的功效測試中研究。本文采用高效液相色譜法測定了千日菊提取物（Acmella Oleracea Extract，AOE）的部分主要成分，用神經肌肉共植體模型測試AOE 對肌肉收縮的抑制作用。用神經肌肉共植體上重構皮膚模型測試AOE 對肌肉收縮的抑制作用。進而設計志愿者人體測試，測試AOE 對于人體皮膚的即時和長效抗皺效果，結果表明，AOE 可以減少皮膚皺紋。用免疫熒光法測試AOE 對TRPV1 的抑制作用，結果表明，1%AOE 即對TRPV1有很好的抑制作用。

關鍵詞：千日菊；千日菊酰胺；神經肌肉共植體；志愿者測試；抗皺 TRPV1；舒緩

隨著護膚品行業的持續發展，植物提取物憑借綠色背景，已然受到消費者熱愛[1，2] 。

但市場對植物提取物護膚功效的擔憂，主要在于很少有植物提取物產品能明確界定其功效成分，而來源于經驗的功效討論又缺乏系統的理論支撐及實際驗證。如果植物提取物既有明確的主要功效成分，又有經驗證的護膚功效，無疑將具有巨大的應用潛力！

千日菊（Acmella oleracea L./ Spilanthes acmellaLinn[3]） 是一種傳統食材，有強烈的辛辣氣味，有提神的作用，還有抗炎、抑菌、退熱、抗氧化、減肥[4] 等作用。但目前還少有公開的文獻報道千日菊提取物在護膚品中的綜合護膚功效。

千日菊中含有氨基酸、三萜、豆甾醇、蜂蠟醇和生物堿，特別是富含N - 烷基酰胺[5]。Shama 等人指出由于烷基酰胺的存在，使得千日菊具有抗炎、抑菌、抗氧化、收斂的作用，并指出烷基酰胺的存在使該植物可用于食品和化妝品[6]。Huang 等的文獻指出，千日菊中的Spilantho（l 千日菊酰胺）具有抗炎、抑菌、鎮痛的作用[7]。

Monroe 等的文章指出，千日菊的花、葉、莖提取物中含有Spilanthol[8]。 Boonen 等的文章指出千日菊提取物中最多的酰胺是Spilanthol[9] （ 千日菊酰胺）。文獻[10，11] 指出，千日菊含多種烷基酰胺，其中最重要的是千日菊酰胺，具有鎮痛功效。因此，本文驗證千日菊提取物中的主要功效成分——千日菊酰胺（Spilanthol），并測試千日菊提取物在神經肌肉共植體、神經肌肉共植體上重構皮膚、人體皮膚測試中的抗皺功效。

TRPV1 為辣椒素受體，激活后會導致鈣離子內流，進而誘發神經反應，出現灼燒等感覺，因此抑制TRPV1 表達可以起到舒緩的作用。

設計體外測試試驗，測試千日菊提取物對TRPV1 的抑制作用，從而測試其舒緩功效。

01 實驗部分

1.1 試劑與儀器

千日菊提取物[ 溶劑為1，3- 丙二醇、水，原料來自法國嘉法獅（GATTEFOSSE）].千日菊提取物中文INCI： 千日菊[（ACMELLA OLERACEA）提取物]。

高效液相色譜（HPLC） 儀（Waters E2695）。

微型神經肌肉共植體24 孔板（Expertise Technologies）。

重構皮膚BETskin DE（Expertise Technologies）。

FOITS（人體皮膚快速光學造影測量設備） 系統，辨識度10μm。

3D 表皮皮膚模型（EpiKutis?）（ 博溪生物），EpiGrowth培養液（博溪生物）、PBS（博士德）、TRPV1 抗體（Abcam）。

1.2 實驗方法

1.2.1 千日菊活性成分測定

高效液相色譜儀分析千日菊酰胺含量。采用RP18 反相分離柱，柱溫40℃；紫外吸收檢測器，檢測器檢測波長240nm；流動相采用乙腈/ 水（50/50），測試時檢測樣品用流動相1/3 稀釋，進樣量10μL。

1.2.2 千日菊提取物在神經肌肉共植體的功效測試

采用運動神經和橫紋肌共植體。用E x p e r t i s eTechnologies公司制備的培養成熟的微型神經肌肉共植體24孔板。

神經肌肉收縮頻率的觀測：用連接攝像機的顯微鏡觀察并對肌肉收縮頻率計數（每次測量為30s 內計數）。

觀察肌肉收縮的過程中，每次觀測至少選擇孔板上3個同類位點，當有2 個位點測試顯示同向結果，則認為測試效果可采信。測試模型用卡利普多作為正向標的，二甲亞砜為負向標的，驗證顯示此方法所得結果為有效結果。

分別用0.6% 和1.2% 的千日菊提取物，作用于神經肌肉共植體培養基，測試不同時間條件下的神經肌肉的收縮頻率。于測試前24h 計量神經肌肉收縮頻率，測試前再次計量神經肌肉收縮頻率，將千日菊提取物注入培養基，于5min/1h/4h 觀測肌肉收縮頻率。觀測到完全的肌肉收縮抑制后，對培養基進行清洗，清洗后于1h/4h/24h 觀測肌肉收縮頻率。

1.2.3 千日菊提取物在神經肌肉共植體重構皮膚模型的功效測試

采用Expertise Technologies 公司制備的重構皮膚BETskin DE。

重構皮膚經過熒光劑皮膚滲透性測試，滲透性低于20%。測試中測試樣品在重構皮膚表面涂敷，停留1h，然后移走重構皮膚，觀測神經肌肉共植體的肌肉收縮頻率（計量方法同1.2.2）。

分別以0.6% ，3.0% 的千日菊提取物用量進行測試。

同步設置安慰劑參照對比組。

1.2.4 千日菊提取物護膚品的志愿者實體功效測試

志愿者經過嚴格篩選，選取20 名志愿者，女性，年齡分布為38～50 歲，健康皮膚，有中到深度魚尾紋。排除孕期、備孕人員，排除超敏性、過敏性皮膚人員，排除糖尿病、哮喘患者。用含有千日菊提取物2% 的膏霜和平行安慰劑膏霜進行單盲測試。受測者對2% 千日菊提取物的膏霜以及安慰劑進行半臉對照，即某志愿者左右臉各用哪款產品隨機確認。使用方法：每日兩次（早晚各一次），連續使用28天，期間用光柵投影分析儀測試D0、D1、D10、D20、D28的眼角魚尾紋情況。

用光柵投影分析儀所得數據分析皮膚粗糙度，數據測量中采用二次平均法取得有效統計數值。數據正態分布用Shapiro-Wilk 測試驗證（閾值1%）。正態分布通過的數據經t 檢驗驗證顯著性，正態分布未通過的采用WILCOXON檢驗驗證顯著性（活性物部分單尾檢驗/參照樣雙尾檢驗）。

1.2.5 測試千日菊提取物對TRPV1 的抑制作用

基于3D 表皮皮膚模型（EpiKutis?），測試千日菊提取物在1%、2%、5% 的濃度下，對TRPV1 蛋白的抑制作用。

以辣椒素CAP 刺激皮膚，設置空白組（無刺激），陰性對照組（有刺激），1，3 丙二醇組，陽性對照組（以反-4-叔丁基環己醇為陽性對照），測試組（1%，2%，5% 千日菊提取物用量），測試對TRPV1 蛋白的抑制作用。

按照測試條件以辣椒素和（或）測試樣品（或陽性對照）涂布于皮膚模型表面，置于CO2 培養箱（37℃，5%CO2） 中孵育24h，然后用PBS 溶液清洗模型表面殘留的受試物。而后用4% 的多聚甲醛進行固定處理，固定24h 后，將模型環切取下，進行辣椒素受體（TRPV1）的免疫熒光檢測。重復3 次。

02 結果與討論

2.1 千日菊活性成分含量測定

所得物為水/ 丙二醇/ 千日菊提取物的混合物，其中千日菊提取物含量大于5%（質量分數）。對此產品進行液相色譜分析，譜圖如圖所示。

液相色譜結果顯示，千日菊提取物中含有Spilanthol千日菊酰胺。

千日菊酰胺分子式為：

2.2 千日菊提取物在神經肌肉共植體的功效結果

測量千日菊提取物作用于神經肌肉共植體模型，0.6%和1.2% 的千日菊提取物所得測試結果如圖所示。

圖2 結果表明，千日菊提取物0.6% 用量，能在1h 內將神經肌肉共植體的收縮頻率從100%（未使用時的神經肌肉共植體肌肉收縮頻率為100%） 降低到0，也就是肌肉收縮停止。在神經肌肉收縮停止后，迅速洗去施用的產品。可以觀察到，神經肌肉的收縮開始緩慢恢復，至洗去后1h，神經肌肉的收縮恢復到接近初始未用產品時的收縮頻率。

而使用1.2% 的千日菊提取物，在5min 內即可將神經肌肉共植體的收縮頻率從100% 降低到0。而后迅速洗去施用產品，肌肉收縮仍顯示為靜止狀態。測試開始4h，肌肉收縮開始緩慢恢復，至測試開始后24h，肌肉收縮恢復至接近初始未用產品時的頻率。

以上結果表明，千日菊提取物具有減少肌肉收縮的效果。而效果的持續性則極大依賴于施用劑量。1.2% 千日菊提取物用量，其單次施用的抑制效果可達24h。

2.3 千日菊提取物在神經肌肉共植體重構皮膚作用的功效結果

分別以0.6% 、3.0% 的千日菊提取物用量進行測試。

同步設置安慰劑參照對比組，所得結果如圖所示。

圖3 結果顯示，0.6% 用量的千日菊提取物在施用后6h（此時已經移走神經肌肉共植體上的皮膚模型），肌肉收縮頻率降到最低值，為初始收縮頻率的28%。此后肌肉收縮開始緩慢恢復，至2h 恢復至接近初始收縮頻率。

3.0% 用量的千日菊提取物也在施用后6h 后達到最低值，此時肌肉收縮頻率為0，即肌肉收縮停止。此后肌肉收縮開始緩慢恢復，至24h 恢復至接近初始收縮頻率的60%。

同步安慰劑則對肌肉收縮沒有任何影響。

以上結果表明，在神經肌肉共植體重構皮膚上施用千日菊提取物，千日菊提取物的作用效果被大幅延緩。但同時被延緩的，還有肌肉收縮的恢復速度。

0.6% 含量的千日菊提取物，在6h 后將肌肉收縮頻

率降至最低（初始收縮頻率的28%），再經將近24h，恢復到施用千日菊提取物之前的肌肉收縮頻率。比單純神經肌肉共植體的作用速率延后5h。而3% 的千日菊提取物，使得24h 后肌肉收縮頻率只恢復到了未施用時的60%。

以上結果說明，重構皮膚的存在，減緩了千日菊提取物的作用速度，同時也延長了千日菊提取物的效果持續的時間。

以上測試結果，說明千日菊提取物可以減少神經肌肉共植體重構皮膚的肌肉收縮，且具有很強的劑量依賴性。

千日菊提取物用量達到一定程度（如3% 以上） 后，神經肌肉共植體上重構皮膚所做的肌肉收縮測試，肌肉收縮在24h 后不會完全恢復。

2.4 千日菊提取物護膚品的志愿者實體功效測試

以15 名志愿者的測試數據進行分析。

對魚尾紋位置的皮膚粗糙度進行分析，所得結果如圖所示。

以上結果表明，在28d 的時間長度內，含千日菊提取物的膏霜對眼角皺紋造成的總體粗糙程度有明顯改善，皺紋總體減少14.2%。這也印證了千日菊提取物抗皺功效的長期持續性。且千日菊提取物在第一天即取得統計學顯著的皺紋改善效果。

提取某志愿者眼角魚尾紋圖片如圖所示。

從以上結果可以看出，志愿者眼角部的魚尾紋情況有明顯視覺可見的改善。

2.5 千日菊提取物對TRPV1 的抑制作用

對空白對照組BC， 陰性對照組（刺激）NC，1，3 丙二醇組（3. 5%），陽性對照組[ 刺激及15.6μg /mL 反-4- 叔丁基環己醇（舒緩辣椒素刺激）]PC，1% 千日菊提取物，2%千日菊提取物，5% 千日菊提取物進行測試。

進行辣椒素受體（TRPV1） 的免疫熒光檢測，顯微鏡下拍照，采集圖片并分析。選取目標蛋白TRPV1 染色顏色，用GraphPad Prism 軟件分析，分析熒光染色的TRPV1表達情況（綠色熒光），得到其相對IOD 平均值。用t-test方法分析結果相對NC 組的顯著性。

所得結果如圖6 所示。

結果顯示，1%、2%、5% 的千日菊提取物，相對陰性對照NC 組，都有很好的抑制TRPV1 的作用，其中1% 千日菊提取物對TRPV1 的表達抑制率達到61%。且相對NC組，測試結果t 檢驗，數據結果顯著。

結果表明， 排除成分中1，3 丙二醇的影響，千日菊提取物對TRPV1 的表達有顯著的抑制作用，且1% 千日菊提取物對TRPV1 的表達抑制作用已經優于PC 組。

03 結論

（1） 驗證千日菊提取物含有酰胺成分——千日菊酰胺（Spilanthol）。

（2） 神經肌肉共植體/ 神經肌肉共植體重構皮膚的肌肉收縮頻率測試說明：千日菊提取物可以減少肌肉收縮。

在神經肌肉共植體重構皮膚模型中，肌肉收縮頻率未達到100% 恢復，提示長期使用千日菊提取物將產生累積的減少肌肉收縮功效。

（3） 人體測試的即時測試結果和長期（28d） 結果表明，2% 千日菊提取物可以顯著減少皮膚的皺紋，降低皮膚粗糙度。且千日菊提取物減少皺紋的功效，具有即時性和長效性，可用于即時抗皺和長效抗皺護膚品。千日菊提取物2% 即可有良好的長效抗皺效果。

（4）1% 千日菊提取物即可對TRPV1 有顯著抑制作用，因此在皮膚舒緩方面可以有所應用。

綜上所述，千日菊提取物是一款良好的即時和長效抗皺活性物，且有一定舒緩功效。