油茶果殼黃酮、多酚純化技術(shù)及抗氧化活性研究

郭永生，吳靜，吳磊，顧震，謝傳奇，熊偉

江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所（南昌 330096）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是中國特有的木本油料，在我國江西、湖南、福建等地廣泛種植。近些年國內(nèi)油茶發(fā)展迅速，朝著萬億級別產(chǎn)業(yè)邁進(jìn)[1]。油茶果殼作為油茶加工過程的副產(chǎn)物，據(jù)統(tǒng)計國內(nèi)每年有超過300萬 t的產(chǎn)量，而油茶果殼大多作為初級燃料和培養(yǎng)食用菌，不但沒有得到充分加工利用，而且會對空氣、水體和生態(tài)造成污染[2-3]。有研究表明，油茶果殼提取物具有一定抗氧化能力，如：彭玲[4]研究表明油茶殼黃酮粗提物對食用油脂的氧化有一定延緩作用；李利敏等[5]研究表明油茶蒲提取物具有較強(qiáng)清除DPPH自由基能力，并發(fā)現(xiàn)油茶蒲提取物抗氧化能力與其多酚及多糖類物質(zhì)含量具有顯著相關(guān)性。此外也有研究對油茶果殼中的抗氧化成分如黃酮、多酚等成分進(jìn)行優(yōu)化提取，如Zhang等[6]采用微波輔助提取，以水為提取溶劑優(yōu)化提取油茶殼中多酚，多酚得率達(dá)15.05%，且酚類提取物中以沒食子酸為主。對果殼中的研究主要集中在活性物質(zhì)的提取上，但獲得的粗提物中含有較多雜質(zhì)，需要進(jìn)一步純化。大孔樹脂以其吸附性能好、吸附效率高、再生簡便、成本低等優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的富集和分離[7]。

油茶果殼中黃酮類和多酚物質(zhì)雖含量低，但來源豐富，成本低，且具有較好的應(yīng)用前景和社會效益。因此以油茶果殼為原料，采用D101型大孔樹脂按照不同濃度梯度的乙醇對油茶果殼乙醇提取物進(jìn)行洗脫純化，對洗脫純化得到的各個部分進(jìn)行總黃酮和總酚含量的測定，通過ABTS+自由基、DPPH自由基清除試驗及鐵離子還原試驗等方法評價其各部分的抗氧化活性，以期豐富油茶果殼開發(fā)和利用的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海盈元化工有限公司）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（麥克林公司）；油茶果殼（江西恩泉油脂有限公司）；抗壞血酸（分析純，上海盈元化工有限公司）；三氯化鐵（分析純，阿拉丁公司）；鐵氰化鉀（分析純，阿拉丁公司）。

JHBE-100A閃氏提取器（智晶生物有限公司）；R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FDU-1200冷凍干燥機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；M200PRO酶標(biāo)儀（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；YC-1800低溫噴霧干燥機(jī)（上海雅程儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶果殼粗提物的備制

稱取油茶果殼置于閃氏提取器粉碎，按1∶20 g/mL的料液比加入70%乙醇-水溶液超聲（400 W，40 min）重復(fù)提取2次，靜置后取上清液進(jìn)行抽濾，進(jìn)行減壓濃縮，轉(zhuǎn)入實驗室低溫噴霧干燥機(jī)在150 ℃進(jìn)行噴霧干燥。

1.2.2 油茶果殼提取物的純化

樹脂預(yù)處理方法：參考鄒蘇蘭等[8]的方法，將50 g D101大孔吸附樹脂用300 mL無水乙醇浸泡24 h充分溶脹后，用95%乙醇沖洗，至洗出液加5倍量蒸餾水時無白色渾濁，蒸餾水洗至無醇味，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

將活化的大孔樹脂裝柱，取10 g油茶果殼粗提取物上樣，靜置吸附一晚，依次用0，10%，30%，50%，70%和100%的乙醇-水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫至無色，分別收集流出液，進(jìn)行減壓濃縮、冷凍干燥，得到各洗脫部分物質(zhì)。

1.2.3 總黃酮的測定

參照李少泓[9]的總黃酮含量測定方法，并作適當(dāng)改動。吸取1 mL樣品（1 mg/mL）或蘆丁標(biāo)樣，加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液搖勻，常溫靜置5 min。依次加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液和2 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，常溫靜置15 min，在波長510 nm處測定吸光度，測定結(jié)果以每克樣品中總黃酮含量（蘆丁計）表示，mg/g。

1.2.4 多酚含量的測定

參照申元福等[10]的方法，并做適當(dāng)改動。吸取1 mL樣品（1 mg/mL）或沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入1 mL超純水和0.2 mL福林酚試劑，充分混勻后靜置3 min后，加入0.6 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，再次充分混勻，在室溫下靜置40 min，取上清液，用酶標(biāo)儀在765 nm波長處測定吸光度。測定結(jié)果以每克樣品中總多酚含量（以沒食子酸計）表示，mg/g。

1.2.5 油茶果殼提取物體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 溶液的配制

分別稱取對照品VC、粗提物及各洗脫部分樣品，用甲醇溶解配制1 mg/mL的母液，用甲醇將母液稀釋至不同倍數(shù)，配制質(zhì)量濃度800.00，400.00，200.00，100.00，50.00，25.00，12.50和6.25 μg/mL的樣品溶液。

1.2.5.2 Fe3+還原能力測定

參考陸永旺等[11]的方法，采用普魯士藍(lán)法測定樣品還原Fe3+能力。取200 μL待測溶液，依次加入500 μL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和500 μL 1%氰化鉀溶液，搖勻后放入50 ℃恒溫水浴鍋中30 min，取出迅速放入冰水中冷卻，加入500 μL 10%三氯乙酸溶液，搖勻、靜置5 min，取500 μL上清液，依次加入500 μL超純水和100 μL 0.1%三氯化鐵溶液，搖勻后靜置10 min，吸取200 μL至96孔板中，于波長700 nm處測吸光度。每個樣品平行測定3次。

參考多肽抗氧化性測定DPPH和ABTS法[12]，進(jìn)行適當(dāng)改動，通過與VC的清除能力作比較，來判定提取物的抗氧化能力。

1.2.5.3 DPPH自由基清除

取100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液于96孔板中，加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。混合均勻后于常溫避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度，每個樣品平行測定3次。VC溶液作為陽性對照組樣品溶液，甲醇溶液作為空白對照組樣品溶液。DPPH清除率按式（1）計算。

式中：A1為空白對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.2.5.4 ABTS+自由基清除

溶液配制完成之后，吸取50 μL待測液溶液與150 μL ABTS+溶液于96孔板中，混合均勻后于常溫下避光反應(yīng)30 min，在波長734 nm處測定吸光度。陽性對照組的樣品溶液用VC溶液替代，空白對照組的樣品溶液用甲醇溶液替代，ABTS+清除率按式（2）計算。

式中：A1為空白對照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 各洗脫部分總黃酮、總多酚含量的測定

由圖1可知，各洗脫部分中總黃酮和多酚含量有明顯差異，其中：總黃酮含量的排序為10%洗脫部分＞30%洗脫部分＞粗提物＞50%洗脫部分＞0%洗脫部分＞70%洗脫部分＞100%洗脫部分；總多酚含量的排序為10%洗脫部分＞30%洗脫部分＞粗提物＞50%洗脫部分＞0%洗脫部分＞70%洗脫部分＞100%洗脫部分。10%乙醇-水和30%乙醇-水洗脫部分的總黃酮和多酚含量較初提物有明顯的提高，其中以10%洗脫部分的總黃酮及總多酚含量最高，分別為648.74和572.48 mg/g，較初提物中含量分別提高2.0和1.8倍，富集效果明顯。但由于油茶殼中含有較高的棕色素[13]，在溶解粗提取及洗脫部分時有一定顏色及含有類黃酮化合物[14]，可能導(dǎo)致黃酮含量的結(jié)果有一定誤差。對比白楊[15]經(jīng)復(fù)配樹脂純化后多酚純度可達(dá)71.73%，可能由于試驗中使用的大孔樹脂沒有經(jīng)過復(fù)配，純化效果不能達(dá)到最優(yōu)。

結(jié)合各洗脫部分產(chǎn)物質(zhì)量，計算總部分的總黃酮及多酚的得率，具體如表1所示。

表1 各洗脫部分總黃酮和總多酚的得率

由表1可以看出，30%乙醇-水洗脫部分中的總黃酮和總多酚的提取效率最高，分別是43.84%和28.52%，其次是10%乙醇-水洗脫部分，因此對于工業(yè)提純來講可以參考該范圍的洗脫溶液。沈福建等[16]通過正交試驗得出，油茶果殼黃酮溶出量為1.709%，試驗只達(dá)到1.3%，這是因為試驗為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，只是經(jīng)過簡單的醇提及油茶果殼品種的不同造成溶出率有差異。

2.2 各洗脫部分抗氧化能力測定

選擇Fe3+還原能力測定對各洗脫部分的抗氧化能力進(jìn)行研究，對Fe3+還原能力越強(qiáng)，吸光度越高，抗氧化活性越強(qiáng)。具體結(jié)果如圖2所示。

圖2 各洗脫部分Fe3+還原試驗結(jié)果

結(jié)果表明，油茶果殼粗提物、各洗脫部分還原Fe3+的能力和濃度都存在一定關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度升高，其還原能力也隨之增加。在相同質(zhì)量濃度下，各洗脫部分的抗氧化能力均弱于VC。其中，在各洗脫部分中，抗氧化能力效果最強(qiáng)的是10%乙醇-水洗脫部分，其次為30%乙醇-水洗脫部分，與多酚及總黃酮的含量保持一致，且較初提物有明顯提高。

還原能力測定結(jié)果表明各洗脫部分能夠向自由基提供質(zhì)子表現(xiàn)出抗氧化能力，因此試驗進(jìn)一步利用DPPH自由基和ABTS+自由基清除試驗，探究各部分的抗氧化劑活性是否通過電子轉(zhuǎn)移途徑實現(xiàn)清除自由基，自由基清除試驗結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 各洗脫部分DPPH自由基清除試驗結(jié)果

圖4 各洗脫部分ABTS+自由基清除試驗結(jié)果

結(jié)果表明，油茶果殼粗提物、各洗脫部分清除DPPH自由基和ABTS+自由基的效果和濃度都存在一定關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度的升高，其清除率也隨之增加，和還原能力測試結(jié)果保持一致，說明其抗氧化活性可能通過電子轉(zhuǎn)移途徑實現(xiàn)清除自由基，可能與黃酮及多酚清除自由基能力實現(xiàn)途徑保持一致[16]。

洗脫部分的自由基清除能力大小為10%洗脫部分＞30%洗脫部分＞粗提物＞50%洗脫部分＞0%洗脫部分＞70%洗脫部分＞100%洗脫部分。低濃度（0～25 mg/mL）時，各洗脫組分的自由基清除能力弱于同濃度VC，但高濃度（＞25 mg/mL）時，10%洗脫部分及30%洗脫部分清除自由基能力接近同濃度的VC。

對比可以發(fā)現(xiàn)，相較于ABTS+自由基清除能力，各洗脫部分的DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加有明顯的降低，可能與ABTS+自由基在水與醇溶液中有良好的溶解性，而DPPH自由基是醇溶性自由基有關(guān)[17]。可能洗脫部分帶有部分的水溶性抗氧化劑，隨著濃度的增加而引起差異。

3 結(jié)論

通過結(jié)果數(shù)據(jù)比較分析各洗脫部分和粗提物的總黃酮含量、多酚含量，以及DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和還原Fe3+能力，試驗表明：10%乙醇-水洗脫純化效果明顯，其總黃酮和多酚含量分別為648.7和572.5 mg/g，較粗提物含量提高2.1倍和1.8倍；結(jié)合各洗脫部分，以30%乙醇-水溶液的總黃酮和總多酚提取效率最高，分別達(dá)到43.84%和28.52%；通過還原能力及自由基清除試驗發(fā)現(xiàn)，10%乙醇-水洗脫部分抗氧化能力最優(yōu)，其次為30%乙醇-水溶液，且其抗氧化活性可能通過電子轉(zhuǎn)移途徑實現(xiàn)清除自由基。

綜上，通過簡單的乙醇-水洗脫工藝可有效富集油茶果殼初提物中的多酚及黃酮成分，同時提高抗氧化能力，為工業(yè)提取油茶果殼黃酮、多酚提供參考意見，進(jìn)一步豐富油茶果殼開發(fā)和利用的理論基礎(chǔ)。