銅藻中巖藻黃素的提取工藝優(yōu)化與含量測(cè)定

邢紫風(fēng)，弓澤華，盛滟，李源，楊絲月，凌俊紅

浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院（舟山 316022）

銅藻（Sargassum horneri）屬褐藻門(mén)墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬的大型海藻，在我國(guó)主要分布于遼寧、浙江、福建及廣東等地[1]。銅藻中主要有褐藻糖膠、褐藻多酚、巖藻黃素、膳食纖維、脂肪酸、多糖等成分[2-4]，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[5-6]。

巖藻黃素是褐藻和微藻（硅藻）產(chǎn)生的一種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)天然產(chǎn)物，占天然類(lèi)胡蘿卜素總產(chǎn)量的10%以上[7-9]。巖藻黃素含有獨(dú)特的高度共軛不飽和系統(tǒng)[10-11]，賦予該化合物優(yōu)良的抗氧化、抗肥胖、抗炎及抗癌活性[12-16]。鑒于動(dòng)物自身無(wú)法合成像類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)化合物[17]，因此巖藻黃素作為高附加值海洋功能食品、食用色素及海洋藥物先導(dǎo)化合物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值[15,18-20]。巖藻黃素的提取方法有溶劑浸提法[21]、超聲輔助提取法[22]、酶提取法[23]、超臨界流體萃取法[24]等，超聲輔助提取法具有操作簡(jiǎn)單、高提取率等優(yōu)點(diǎn)。因此為研究巖藻黃素在海藻中的生物量，以銅藻為研究對(duì)象，優(yōu)化巖藻黃素的提取工藝，測(cè)定其在銅藻中的含量，以期對(duì)銅藻進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]；G-100S超聲波清洗器（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；OHAUS EX125DZH分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；Vortex-Genie 2渦旋儀（美國(guó)Scientific Industries公司）。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮（均為分析純）；所用水為二次蒸餾水；巖藻黃素對(duì)照品（純度大于95%，山東潔晶集團(tuán)有限公司）；銅藻[尋山集團(tuán)有限公司（山東）]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱(chēng)取13.2 mg巖藻黃素對(duì)照品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到1.32 mg/mL溶液，精密吸取1 mL上述溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到0.132 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)取1.0 g銅藻，置錐形瓶中，加40 mL甲醇，稱(chēng)重，于60 ℃超聲提取2次（200 W和53 kHz），每次45 min，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，合并2次提取液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

精密吸取1 mL“1.2.1”項(xiàng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液置100 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到1.32 μg/mL溶液，使用紫外可見(jiàn)分光光度儀，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行光譜掃描，確定選用447 nm作為巖藻黃素測(cè)定的波長(zhǎng)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取適量“1.2.1”項(xiàng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成8.80，6.60，3.30，1.65，0.83和0.55 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度溶液，以甲醇為參比，用紫外可見(jiàn)分光光度儀在447 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5 銅藻中巖藻黃素的測(cè)定

稱(chēng)取1.0 g銅藻，按“1.2.2”項(xiàng)的方法制備3份供試品溶液，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即得巖藻黃素含量。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

1.2.6.1 提取溶劑考察

稱(chēng)取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質(zhì)量的10倍體積數(shù)（mL）分別加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，在室溫下超聲提取30 min，提取液稀釋后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量，比較不同溶劑對(duì)巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.2 溶劑體積考察

稱(chēng)取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，分別按樣品質(zhì)量的10，20，30，40和50倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下超聲提取30 min，提取液稀釋后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量，比較溶劑體積對(duì)巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.3 提取時(shí)間考察

稱(chēng)取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質(zhì)量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下分別超聲提取10，30，45和60 min，提取液稀釋后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量，比較提取時(shí)間對(duì)巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.4 提取溫度考察

稱(chēng)取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質(zhì)量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，分別在25，45，60和75 ℃條件下超聲提取30 min，提取液稀釋后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量，比較提取溫度對(duì)巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.5 提取次數(shù)考察

稱(chēng)取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質(zhì)量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下分別超聲提取1，2和3次，每次45 min，提取液稀釋后測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素含量，比較提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃素含量測(cè)定方法學(xué)研究

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，巖藻黃素在0.55～8.80 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程為A=0.109 9C-0.007 1，r=0.999 3。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，記錄吸光度，巖藻黃素吸光度的SRSD為0.44%（表1），說(shuō)明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.2.2”項(xiàng)的方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算得出巖藻黃素含量的SRSD為3.1%（見(jiàn)表2）。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12和24 h測(cè)定，記錄吸光度。巖藻黃素吸光度的SRSD為3.0%（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=8）

2.1.5 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法。精密稱(chēng)取9份1.0 g已知含量的銅藻樣品，分別精密加入適量高、中、低3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)的操作，制成加樣回收率供試液，在447 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為98.7%，SRSD為1.9%（見(jiàn)表4）。

表4 銅藻中巖藻黃素的回收率試驗(yàn)（n=9）

2.2 銅藻中巖藻黃素的含量

以“1.2.5”項(xiàng)制備的供試品溶液中巖藻黃素含量按式（1）計(jì)算，結(jié)果分別為518.1，517.8和521.6 μg/g，巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。

式中：C為樣品溶液中巖藻黃素的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品溶液體積，mL；M為銅藻質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)

以巖藻黃素含量為指標(biāo)，單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1～圖5所示。

圖1 提取溶劑對(duì)巖藻黃素含量的影響

圖2 提取溶劑體積對(duì)巖藻黃素含量的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)巖藻黃素含量的影響

圖4 提取溫度對(duì)巖藻黃素含量的影響提取2次時(shí)，巖藻黃素含量最高。

圖5 提取次數(shù)對(duì)巖藻黃素含量的影響

結(jié)果表明，巖藻黃素在甲醇溶劑中含量最高，在乙醇溶劑中次之。

提取溶劑用量從10倍增加到50倍，在40倍量時(shí)巖藻黃素含量最大，但增加到50倍有小幅下降。

巖藻黃素含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)總體趨勢(shì)是先上升，至45 min時(shí)趨于穩(wěn)定，但在60 min時(shí)出現(xiàn)小幅下降，這可能是由于巖藻黃素穩(wěn)定性差，時(shí)間長(zhǎng)使其被破壞。

巖藻黃素的含量隨著提取溫度的升高總體趨勢(shì)是先上升，至60 ℃時(shí)最高，但在75 ℃時(shí)明顯下降，這可能是由于巖藻黃素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫會(huì)使其破壞。

3 討論

3.1 最優(yōu)的提取工藝

銅藻中巖藻黃素的含量十分豐富，是一種理想的巖藻黃素提取原料，而超聲輔助法提取巖藻黃素的提取效率高、方便快捷。提取溶劑的考察，選取4種常用的溶劑，提取效果是甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯，可能由于甲醇的穿透能力強(qiáng)于其他3種溶劑，故甲醇提取效果最好。而溶劑用量、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)考察以單因素試驗(yàn)得出，最優(yōu)條件為提取溶劑甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，每次45 min。

3.2 試驗(yàn)中的注意事項(xiàng)

由于巖藻黃素遇光不穩(wěn)定，極易分解，故在試驗(yàn)過(guò)程中要保持避光。

制備的供試品溶液中存在細(xì)小粉末雜質(zhì)，干擾測(cè)定。因此在測(cè)定前使用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)供試品溶液。

3.3 分析方法的驗(yàn)證

建立紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定銅藻中巖藻黃素含量的方法，并通過(guò)線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、提取回收率等方法進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.55～8.80 μg/mL范圍內(nèi)，巖藻黃素質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（回歸方程為A=109.95C-0.007 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3），精密度SRSD為0.44%，重復(fù)性SRSD為3.1%，回收率為96.6%～102.2%，證明建立的紫外可見(jiàn)分光光度法適合于測(cè)定銅藻中巖藻黃素含量，最終測(cè)得銅藻中巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。

4 結(jié)論

通過(guò)超聲輔助法從銅藻中提取巖藻黃素，以提取含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化巖藻黃素的提取工藝，研究得出巖藻黃素最佳提取工藝：提取溶劑甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取次數(shù)2次，每次45 min。最優(yōu)工藝條件下得到的銅藻中巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)為銅藻的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。