竹筍多糖提取工藝優化及抗氧化能力研究

李俊杰 ，楊愛國，張文艷 ，王銳，王磊，亢凱杰*

1. 昭通學院化學化工學院（昭通 657000）；2. 云南省高校高原特色功能食品研究重點實驗室（昭通 657000）

竹筍，別名筍、筍子等，大量分布于我國云貴川、廣西、江南地區。竹筍具備低脂、低糖和多纖維的生物功能特性，營養豐富，能促消化、防便秘，也是減肥良品。而且竹筍還含有大量人體所必需的氨基酸、維生素和礦物質等[1]。市面上竹筍產品主要是筍干、酸筍和其他制品，其中酸筍最受人們青睞。據統計，廣西柳州特色小吃“螺螄粉”因添加酸筍而使其味道獨特走紅全國，因此當地竹筍的經濟價值上漲，成為致富增收的新途徑[2-3]。竹筍除用于鮮食，它活性成分的開發也備受關注。據報道，竹筍多糖對人體過多的氧自由基有很好的清除作用，有延緩衰老的作用[4]。食品行業中，抗氧化能力指數是衡量食品、果汁和添加劑品質的重要標準。周芷冉等[4]對竹筍多糖進行抗氧化研究表明，竹筍多糖在DPPH、羥自由基清除能力等方面均表現出良好的活性。此次研究采用廣西柳州麻竹筍為原料，對竹筍多糖進行提取、分離純化后，對其體外抗氧化能力進行評估，為竹筍資源的拓展和開發功能性新食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣西麻竹筍；醋酸鉛、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、冰醋酸、乙醇、鄰苯三酚（均為分析純，天津風船化學試劑有限公司）；福林酚（博林達科技有限公司）；DEAE-52纖維素（北京瑞達恒輝科技發展有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-2700，日本島津企業管理有限公司）；旋轉蒸發儀（YRE-2000A，鞏義市予華儀器有限公司）；層析柱（16 mm×100 cm，瑞達恒輝有限公司）；離心機（Cenlee20R，湖南湘立科學儀器有限公司）；全波長酶標分析儀（PT-3052C，北京普天新橋技術有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 竹筍多糖提取工藝

竹筍→粉碎→水浸提→濾液→濃縮→除蛋白→離心→上清液→竹筍粗多糖溶液→層析→不同組分竹筍多糖溶液

1.3.2 多糖含量的測定

參照文獻[5]的試驗方法。吸取0～1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液于比色管中，用蒸餾水補充至2.0 mL，加1.0 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃H2SO4，搖勻，靜置30 min，于490 nm波長處測定吸光度，并繪制標準曲線，樣品測定同上。

1.3.3 竹筍多糖提取單因素試驗

（1）液料比的影響：稱取各100.0 g竹筍勻漿5份（下同），分別按液料比15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）加入蒸餾水；于95 ℃水浴鍋中浸提4 h，在4 200 r/min下離心8 min，收集上清液，剩余殘渣重復提取1次，合并上清液，濃縮后冷凍干燥，按式（1）計算多糖提取率。

式中：m為多糖質量，g；m1為竹筍質量，g。

（2）提取時間的影響：樣品按（1）中最優液料比，置于95 ℃水浴鍋中分別浸提2，3，4，5和6 h，后續其他操作同（1）執行。

（3）提取溫度的影響：樣品按（1）中最優液料比和（2）中最佳時間，分別在80，85，90，95和100℃下提取，后續其他操作同（1）執行。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇液料比、提取時間、提取溫度3個自變量，以竹筍多糖提取率為響應值，根據Design-Expert 8.0.6設計試驗，由Box-Behnken中心組和試驗原理，設計三因素三水平響應面試驗分析。

1.3.5 DEAE-52纖維素分離竹筍多糖

參照Shang等[6]的方法，將DEAE-52纖維素裝入層析柱中，通入蒸餾水洗脫12 h后加入3 mL 3%的竹筍多糖溶液，分別用0.1，0.2和0.4 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，控制速度1 min/mL，每10 min收集1管，按照1.3.3測得吸光度，以橫坐標為洗脫管數，縱坐標為吸光度，得曲線。

1.3.6 竹筍多糖體外抗氧化性的研究

參照文獻[7]對麻竹筍多糖組分的DPPH和羥自由基清除率進行測定。DPPH清除率采用DPPH-乙醇法，以VC作為對照進行；羥自由基清除率采用Fenton反應體系法，以蒸餾水作為空白對照執行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對多糖提取率的影響

由圖1可知，在液料比15∶1（mL/g）時，竹筍多糖提取率最低，為1.76%，說明竹筍多糖未被充分提取出來，隨著液料比的增加，提取率不斷升高，多糖充分釋放出來，液料比達到30∶1（mL/g）時，提取率達到最高，為2.81%。此時繼續提高液料比，多糖提取率有下降趨勢，可能因為大量溶劑的加入，使得提取過程中多糖部分流失。張帥等[8]對筍殼多糖進行提取時發現，液料比超過30∶1（mL/g）時，多糖提取率下降明顯，可能因為過多的溶劑對樣品細胞中某些物質的溶出有促進作用，改變細胞滲透壓，不利于多糖的溶出。多糖的提取屬于傳質過程，雖然傳質的驅動力固-液兩相可以增加多糖的擴散，擴散達到平衡時，繼續增大液相比例并未提高產量時反而會降低效能，造成資源浪費。因此可選擇25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）的液料比進行后續試驗。

圖1 液料比對竹筍多糖提取率的影響

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2可知，竹筍多糖提取率隨著時間的增加而升高，5 h時提取率最高，達2.88%。繼續延長時間，竹筍多糖提取率不再升高，提取時間達到6 h時，多糖提取率下降明顯，為2.60%。此變化趨勢與陳蕾俊等[9]研究幾乎一致。雖然長時間的提取更有利于多糖從細胞中滲透出來，但多糖的分子結構在長時間高溫下有可能被水解。因此選擇4，5和6 h進行后續試驗。

圖2 提取時間對竹筍多糖提取率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，提取溫度80 ℃時，竹筍多糖提取率最低，為1.74%，可能由于溫度過低，不利于多糖的滲出，隨著溫度的升高，提取率增加，溫度達到90℃時達到峰值2.91%，說明高溫處理有利于多糖的提取。而繼續升高溫度，提取率略有下降。高溫可以提高多糖的擴散系數和溶解度，從而提高多糖提取率，而且理論上隨著溫度的升高，多糖提取率會升高，但多糖在長時間高溫條件下，其糖鏈有可能會發生斷裂而造成多糖分子量下降而被透析除去，使得提取率下降[9]。因此選擇80，85和90 ℃進行后續試驗。

圖3 提取溫度對竹筍多糖提取率的影響

2.2 竹筍多糖的響應面優化結果

2.2.1 響應面試驗設計

在單因素試驗研究下，選擇液料比25∶1，30∶1和35∶1（mL/g），提取時間4，5和6 h和提取溫度80，85和90 ℃，設計響應面試驗因素水平表，在Design-Expert設計試驗下，由Box-Behnken中心組和試驗原理，得出表1因素水平試驗編碼表。

表1 響應面試驗因素水平設計表

2.2.2 回歸模型分析

通過響應面回歸分析，得到竹筍多糖提取率（Y）與液料比、提取時間、提取溫度的二次多項回歸模型。竹筍多糖的提取率可通過試驗數據的多元回歸分析，以二階多項式方程估計預測模型：Y=2.86+0.46A+0.23B+0.28C-0.26AB-0.025AC+0.002 5BC-0.32A2-0.17B2-0.21C2，響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.3 顯著性分析

由表3可知，模型P值＜0.000 1，表示該模型顯著并且具有統計學意義。失擬項P值=0.339＞0.05，表示失擬項差異不顯著，說明該模型相對于純誤差并不顯著，觀測值與預測值得到很好擬合，該多項式模型的準確性和一般可用性足夠。各系數的顯著貢獻值由F值檢驗的P值決定。有學者研究證明定系數（R2）和調整決定系數（Radj2）評價模型的解釋力，如果兩者的值越接近1，說明模型足以描述觀測值與預測值之間關系。模型相關系數R2=0.973，該系數接近1，而擬合模型的決定系數R2=0.938，Rpred2（預測系數）=0.750，兩者之差約0.2，說明該模型擬合度較好。對回歸模型系數的顯著性結果分析可知，一次項A、B、C和二次項A2、C2系數的顯著性都＜0.01，表明差異極顯著，3個因子對竹筍多糖提取率影響較為敏感，二次項B2系數接近0.05，差異顯著。通過F值可知，該試驗的3個影響因子對竹筍多糖提取率的影響大小順序為液料比＞提取溫度＞提取時間。根據響應面建立的模型可預測出竹筍多糖提取率的最佳工藝條件：液料比32.94∶1（mL/g）、提取時間5.23 h、提取溫度88.08 ℃，在該模型設計試驗的預測下多糖提取率為3.11%。為驗證該預測值的可靠性，選擇液料比33∶1（mL/g）、提取時間5.2 h、提取溫度88 ℃進行3次平行試驗，提取率為3.06%，3.08%和3.14%，平均值為3.09%，與預測值接近，表明通過響應面優化方法得出的結論可靠，結果預測良好。

表3 響應面模型方差分析

2.2.4 各因素之間的交互作用

理論上響應曲面圖的拋物面開口向下，說明響應結果具有極大值點；響應曲面圖的陡緩程度可反映因素兩兩交互效應的強弱，曲面越陡表示兩因素交互作用顯著，反之則不顯著。由圖4可知，液料比對響應值的影響比提取時間和提取溫度較為顯著，而提取溫度對響應值的影響比提取時間較為顯著，說明各因素之間的具有一定的交互作用，對竹筍多糖提取率有一定影響。3個因素中固定任意1個為零水平，改變其余因素時，隨著其水平的提高，多糖提取率均呈先上升后下降趨勢。液料比和提取時間的曲面圖較陡峭，說明兩者交互作用顯著，而液料比、提取時間與提取溫度的交互作用不顯著。該結果與方差分析結果基本一致。

圖4 各因素交互作用對提取率影響的響應面圖

2.3 分離純化結果分析

由圖5可知，將竹筍粗多糖用DEAE-52纖維素分離純化，經不同濃度NaCl溶液洗脫竹筍粗多糖溶液，得到3個組分。經0.1 mol/mL NaCl洗脫得到的組分W1，位于第10～第25號試管，0.2 mol/mL NaCl溶液洗脫得到第2、第3組分W2、W3，分別位于第41～第56號和第63～第71號，0.4 mol/mL的NaCl溶液洗脫沒有峰，說明多糖溶液已全部分離出來，計算出得率分別為29.53%，45.24%和9.62%。

圖5 竹筍粗多糖的分離純化

2.4 抗氧化性測定結果分析

由圖6可知，隨著竹筍多糖溶液濃度不斷增加，各組分對羥自由基和DPPH的清除率也隨著增加，但W2組分的竹筍多糖溶液對羥自由基抑制率明顯高于W1、W3組分，其清除率大小為W2＞W1＞W3。W3組分的竹筍多糖溶液對DPPH清除率明顯高于其他組分，清除率大小為W3＞W2＞W1。各組分對羥自由基的清除率明顯優于對DPPH的清除率，且W1、W2、W3對羥自由基的清除率的IC50（半數抑制濃度）分別為0.49，0.64和0.73 mg/mL。根據Fenton反應原理推測，竹筍多糖有很強的螯合金屬離子或惰化金屬離子的能力，能有效清除羥自由基，這一理論已基本被證實。周芷冉等[4]證實了竹筍多糖對羥自由基的清除率可達80%。張帥等[8]對竹筍殼多糖組分進行抗氧化研究，結果表明多糖組分濃度1.0 mg/mL時，其對羥自由基清除率可達87.70%，說明竹筍殼多糖抗氧化效果明顯。由此可知W1、W2、W3多糖組分對羥自由基和DPPH的清除效果有一定合理性。

圖6 各竹筍多糖組分的抗氧化能力研究

3 結論

采用響應面法優化熱水浸提竹筍多糖的工藝參數，用DEAE-52纖維素層析柱對竹筍粗多糖進行分離得到3組不同組分，并對其進行體外抗氧化能力研究。通過單因素試驗和響應面試驗優化得到竹筍多糖提取工藝條件，即液料比33∶1（mL/g）、提取時間5.2 h、提取溫度88 ℃，在該條件下竹筍多糖提取率為3.09%，各因素之間對竹筍多糖提取率有一定影響，而液料比和提取時間兩因素之間交互作用較顯著，影響較大。竹筍多糖分離純化后得到3個組分W1、W2、W3，各組分對羥自由基、DPPH清除率均有一定清除作用，其中：W1組分對羥基自由基、DPPH的清除率分別為80.24%和18.44%；W2的清除率分別為94.01%和36.42%；W3的清除率分別為78.45%和43.17%。試驗通過對竹筍多糖的提取、分離及抗氧化的研究為竹筍資源開發出功能性食品提供一定理論依據。