毛酸漿果渣黃色素的提取、穩定性及抗氧化性研究

李向榮，潘宇，丁一鳴，劉鑫，黃玉舟 ，王晶晶*

1. 錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121000）；2. 遼寧智慧安鮮物聯網科技有限公司（沈陽 110000）；3. 遼寧通正檢測有限公司（沈陽 110000）

毛酸漿（Physalis pubescenceL.），又名洋菇娘，是酸漿屬的1年生草本植物，成熟后為顏色金黃的小漿果。其因味道酸甜可口，富含多種營養成分為人們所喜愛。研究表明，毛酸漿具有抗菌、抗氧化、去熱降火、清肺消腫等多種健康益處[1]。由于毛酸漿屬于季節性水果，受到時間和儲運的限制，鮮果產業鏈效益不高。近年來，國內學者對毛酸漿的深加工技術進行研究，包括飲料、果醬、罐頭、果脯、果醋等[2]。然而，由此產生的大量副產物和廢物卻未得到開發利用，嚴重影響產業鏈的完整性。毛酸漿果實出汁率可達60%以上，果渣產出率接近30%。有報道顯示[3]，毛酸漿果和宿萼中含大量黃色素，其主要成分為類胡蘿卜素。但關于毛酸漿色素的研究顯示，提取方法單一，工藝優化參數不夠，色素的穩定性和抗氧化性等功能性評價關鍵數據不足，缺乏轉化為工業化生產的關鍵技術研究。關于毛酸漿果渣綜合利用開發的研究尚未見諸報道。

天然色素因來源廣泛，安全性高，具有多種生物活性[4-6]，而成為近年來的研究熱點。天然色素提取方法主要有水浴提取法[7]、超臨界流體萃取法[8]、酶法[9]和微波萃取法[10]。已報道的毛酸漿色素提取方法為傳統的熱法浸提，其操作過程復雜，效率低下，能耗大。許多研究表明，超聲波輔助提取法是一種高效、低耗能、易于工業化生產的提取方法[11]，已被運用于花青素、酚類及類黃酮的提取加工[12-14]。試驗對超聲波輔助提取工藝進行系統的研究，分析所得的毛酸漿果渣色素的穩定性和抗氧化活性，為毛酸漿果渣色素的綜合開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛酸漿（市售）；無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（AR分析純，天津市天力試劑有限公司）；β-胡蘿卜素標準品（UV≥98%，索萊寶生物有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

UV-5100B型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；GTSONIC-P型超聲器（廣東固特超聲股份有限公司）；HR/T20MM型立式冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；K2025型高效液相色譜儀（山東悟空儀器有限公司）；Readmax 1900型光吸收波長酶標儀（上海閃譜科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

取新鮮毛酸漿果實，榨汁后取果渣，在50 ℃干燥箱中干燥3 h，取出果渣，經粉碎后得毛酸漿果渣粉，于4 ℃密封避光保存。

1.3.2 毛酸漿果渣色素提取溶劑的選擇

準確稱取0.5 g毛酸漿果渣粉，分別加入5 mL的60%丙酮、丙酮、乙醇、乙酸乙酯和石油醚溶劑，于50 ℃恒溫振蕩浸提2 h，按4 500 r/min離心15 min，取上清液，對比觀察色素溶出效果。

1.3.3 毛酸漿果渣色素最大吸收波長的掃描

采用1.3.2小節中色素溶出效果最好的溶劑為提取溶劑，在350～600 nm范圍內對提取溶液進行波長掃描，確定毛酸漿果渣色素的最大吸收波長。

1.3.4 毛酸漿果渣色素提取工藝的優化

根據1.3.2和1.3.3小節的結果，以丙酮為溶劑，采用超聲波輔助溶劑法進行提取，高速離心后取上清液，以吸光度（A）作為提取效果評價指標，分別探究超聲時間（10，15，20，25和30 min）、超聲功率（60，120，180，240和300 W）、超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃）和料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）對毛酸漿果渣色素提取效果的影響。在單因素試驗基礎上，進一步采用響應面試驗設計進行優化試驗，設計因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平

表2 響應面試驗設計及結果

1.3.5 毛酸漿果渣黃色素中類胡蘿卜素的檢測

采用優化后的工藝提取毛酸漿果渣黃色素，以β-胡蘿卜素為標準品，根據胡利強等[15]方法，采用高效液相色譜法對果渣色素中的類胡蘿卜素含量進行檢測。稱取20 mg標準品，用二氯甲烷溶解，配制質量濃度梯度分別為0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 μg/mL系列標準工作液。所得標準曲線方程為y=136.6x-22.811，R2=0.991 2。

1.3.6 毛酸漿果渣黃色素穩定性評價

以色素保存率為評價指標，分別檢測溫度（30，40，50，60和70 ℃，保溫1 h）、pH（pH 4，6，8，10和12，室溫放置3 h）和光照條件對毛酸漿果渣黃色素穩定性的影響。光照試驗中，以暗室、室內、室外分別等替避光、自然光和強光（模擬高強度紫外線照射）的處理條件，放置5 d。色素保存率按式（1）計算[16]。

式中：S為色素保存率，%；A0為初始吸光度；AX為經處理后測得吸光度。

1.3.7 毛酸漿果渣黃色素抗氧化評價[17-19]

以VC為陽性對照品，分別考察不同濃度毛酸漿果渣黃色素對DPPH·和ABTS·的清除活性。DPPH·自由基清除率按式（2）計算，ABTS·自由基清除率按式（3）計算。

式中：A1為樣品待測液和配制的DPPH溶液對應測得的吸光度；A2為樣品待測液和無水乙醇對應測定的吸光度；A0為DPPH-乙醇溶液和溶解樣品的試液測定的吸光度。

式中：A0為ABTS的吸光度；A1為樣品待測液和ABTS對應測定的吸光度；

1.3.8 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取毛酸漿果渣色素的效果

由圖1可知，丙酮提取毛酸漿果渣色素的溶出效果最佳。丙酮在色素提取方面應用廣泛，如蠶沙中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取[20]，酸漿宿萼和紅雪茶中類胡蘿卜素的提取[21-22]等。研究表明，丙酮被廣泛用于提取類胡蘿卜色素。由于前期報道中提示[3]，毛酸漿果富含類胡蘿卜色素，因此，在后續研究中，采用丙酮作為毛酸漿色素的提取溶劑。

2.2 最大吸收波長的確定

圖2顯示，毛酸漿果渣黃色素的最大吸收波長為450 nm。

圖2 毛酸漿果渣色素波長掃描圖

2.3 毛酸漿果渣黃色素提取單因素試驗結果

2.3.1 超聲時間對果渣黃色素溶出的影響

由圖3可見，提取時間25 min時吸光度最大，超過25 min后，吸光度顯著下降。這可能由于提取時間過長導致色素分子的部分化學鍵發生斷裂，破壞色素小分子的穩定結構。超聲時間25 min時色素小分子的運動速度加快增強介質的穿透力，加速色素的溶出。

圖3 超聲時間對果渣色素吸光度的影響

2.3.2 超聲功率對果渣黃色素溶出的影響

由圖4可知，超聲功率180 W時，果渣色素的提取效果最佳。超聲波工作時會產生一定的熱能和機械效應，會對植物的組織學結構及存在狀態造成影響，產生的機械效應過小時，果渣植物細胞沒有完全破碎，其色素釋放不完全；隨著功率增大，其帶動的空化效應和波動效應對包裹目標物的植物細胞壁破壞強烈，色素更易析出。

圖4 超聲功率對果渣色素吸光度的影響

2.3.3 超聲溫度對果渣黃色素溶出的影響

由圖5可見，超聲溫度50 ℃時，提取色素的效果最好。分析可知，毛酸漿果渣色素的吸光度隨著超聲溫度的上升而加大，溫度從40 ℃上升到50 ℃時，吸光度變化顯著。溫度繼續增加，色素吸光度變化不顯著。綜合考慮，將超聲溫度設為50 ℃。

圖5 超聲溫度對果渣色素吸光度的影響

2.3.4 料液比對果渣黃色素溶出的影響

由圖6可知，料液比1∶15 g/mL時，吸光度達到峰值。隨著溶劑量的增大，吸光度的變化趨勢呈先上升后下降。當溶劑量在體系中存在較少時，果渣色素不能充分溶出到提取劑中；隨著濃度差減小，沒有足夠的動能傳播介質，色素不能充分溶出釋放；隨著溶劑量的增大，果渣中的色素溶出逐漸增多且達到相對飽和的臨界狀態，提取效果最好。繼續增大溶劑量，物料被過分稀釋，導致吸光度降低，則達不到理想的提取效果。

圖6 料液比對果渣色素吸光度的影響

2.4 毛酸漿果渣黃色素的響應面優化試驗結果與分析

毛酸漿果渣黃色素提取的響應面試驗結果如表2所示。色素吸光度（A）與各項因素建立的回歸方程為吸光度（A）=0.82+0.034A+0.042B+0.040C-0.025D-0.023AB+0.056AC+4.25×10-3AD-0.065BC+2×10-3BD-3×10-3CD-0.1A2-0.13B2-0.13C2-0.097D2。對回歸模型進行系列方差分析，其結果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析

由表3可以看出，所建立的回歸模型顯著，失擬項不顯著，變異系數5.26%＜10%，說明非試驗因素對色素吸光度的結果影響不大，模型具有較好的穩定性。模型相關系數R2為0.953 3，說明模型跟實際測試的結果擬合度較好。A（超聲功率）、B（料液比）、C（超聲溫度）和D（超聲時間）均顯著影響色素溶出效果，影響大小順序為料液比＞超聲溫度＞超聲功率＞超聲時間。而且，超聲功率和超聲溫度，以及料液比和超聲溫度具有極顯著的交互影響作用。

如圖7～圖12所示，試驗的響應值（吸光度A）受超聲溫度、超聲時間、超聲功率和料液比交互影響的三維立體圖，反映4種因素對吸光度（A）的影響程度及影響趨勢的不同。采用響應面法優化分析得到的毛酸漿果渣色素的最佳提取條件為超聲溫度51.73 ℃、超聲時間24.36 min、超聲功率191.85 W、料液比1∶15.52 g/mL，理論吸光度為0.831?？紤]到實際操作的方便性及可能存在誤差，設置超聲溫度50 ℃、超聲時間25 min、超聲功率180 W、料液比1∶15 g/mL。此時，果渣黃色素提取液吸光度為0.841±0.015，與理論值相差不大，說明經響應面法得到的優化結果可靠。

圖7 液料比與超聲功率的交互作用

圖8 超聲溫度與超聲功率交互作用

圖9 超聲時間與超聲功率的交互作用

圖10 超聲溫度與液料比的交互作用

圖11 超聲時間與液料比的交互作用

圖12 超聲時間與超聲溫度的交互作用

2.5 毛酸漿果渣黃色素中的類胡蘿卜素含量

如圖13所示，所得毛酸漿果渣色素中類胡蘿卜素含量為3.947±0.135 mg/100 g DW。Hempel等[3]報道，毛酸漿果中含有1.28～1.38 mg/100 g FW的類胡蘿卜素，試驗采用超聲波法獲得的色素中類胡蘿卜素含量高于該含量，可見毛酸漿果渣是適合提取色素的原料。

圖13 毛酸漿果渣黃色素中類胡蘿卜素的檢測色譜圖

2.6 毛酸漿果渣黃色素的穩定性分析

由圖14和圖15可知，溫度、pH和不同光照條件對毛酸漿果渣黃色素的穩定性有不同程度影響。隨著溫度的升高，色素保存率有下降趨勢，在試驗溫度范圍內，保存率可達90%以上，說明其具備一定的熱穩定性。試驗結果表明，毛酸漿果渣色素在酸性條件下無法保持穩定的存在狀態。因果渣色素在酸性作用下催化，其環氧化合物會重新排列，導致色素降解。pH接近中性時，色素有較好的穩定性。在堿性條件下，色素保存率下降。光照是影響色素穩定性的重要因素，毛酸漿果渣黃色素保存效果是避光＞自然光＞強光，且在高強度紫外線照射下，色素易分解。分析因其中蘊含的類胡蘿卜素吸收過多的紫外線且完全暴露在陽光的照射條件下，不光導致溶液溫度的升高，且強紫外線會破壞連接穩定的化學鍵，使色素分子結構發生空間旋轉異構，使顏色發生變化。所以，在色素儲存和應用中應避免陽光直射及紫外線照射，以求保持其良好的色澤。

圖14 溫度和pH對果渣黃色素的影響

圖15 光照對果渣黃色素的影響

2.7 毛酸漿果渣黃色素抗氧化活性

由圖16可知，毛酸漿果渣黃色素具有一定清除DPPH和ABTS自由基的能力，且具有濃度依賴性關系，隨著濃度的增大，清除率逐漸增加。

圖16 DPPH和ABTS自由基清除效果圖

3 結論

試驗表明，毛酸漿果渣黃色素中富含類胡蘿卜素，采用優化后工藝參數，即料液比1∶15 g/mL，超聲功率180 W，50 ℃下超聲提取25 min，所得果渣黃色素中類胡蘿卜素含量為3.947±0.135 mg/100 mg。該色素具有較好的抗氧化活性，適宜在60 ℃以下，pH中性環境下避光保存。試驗為毛酸漿果渣的綜合利用開發提供參考。