3種食用菌抗氧化抗發炎的對比研究

鄧藝恒，黃永銘，馮亞棟，張書迪，王貴弘，龐海月*

1. 廈門醫學院，天然化妝品福建省高校工程研究中心（廈門 361023）；2. 廈門醫學院，公共衛生與醫學技術系（廈門361023）；3. 福建農林大學生命科學學院，生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室，福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室（福州 350002）

福建省是銀耳、猴頭菇、秀珍菇3種食用菌的生產基地，具有地方特色和普及性。銀耳主要活性成分為銀耳多糖（Tremellam），其具有護肝解毒、養顏護膚等功能[1-2]。銀耳多糖通過提高血清、肝臟和心臟部位GSH-Px、SOD活性并降低MDA濃度（P＜0.01），顯著提高機體抗氧化能力[1,3]，且隨著濃度的增加，其抗氧化能力隨之增強[5]。服用銀耳多糖對炎癥與抗炎系統的激活均有一定抑制作用[4]。猴頭菇是藥食兩用真菌，具有抗衰老、抗癌等功效，常用于治療慢性胃炎、十二指腸與胃潰瘍等疾病[6]。猴頭菇含有70多種次生代謝物，主要包括猴頭多糖、猴頭菌素、猴頭菇酮等[7]。猴頭多糖可提高小鼠肝臟和腦中SOD的活力[8]。猴頭菇酮、猴頭菌素及猴頭多糖具有抗炎作用[9]。秀珍菇，作為一種極具營養價值的珍稀食用菌，具有滋補身體、安神除煩等生理功能，有著“菇中極品”的美譽[10-12]。呂建敏等[13]在秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠體內抗腫瘤作用研究中證明其具有較好的抑腫瘤作用。其子實體還包含抗氧化性較強的硒元素[14]。其內的多糖物質可降低IL-6、TNF-α、NF-B的含量及活性，表明其能夠通過抑制炎癥因子的數量和活性發揮抗炎的作用[15]。此次試驗旨在研究三者的生理活性，進而將其開發為保健品、食品、功效性化妝品，開拓更廣闊的經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

JY92-IIN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；V-100旋轉蒸發儀（BUCHI Labortechnik AG）；SpectraMax i3x多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；FDU-1200冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）。

銀耳、猴頭菇、秀珍菇（福建省古田縣）；馬鈴薯葡萄糖水、酵母粉、麥芽提取粉（廣東環凱微生物科技有限公司）；瓊脂、硫酸鎂、二甲亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）；無水磷酸二氫鉀、維生素C（VC）、左旋多巴[均為生工生物工程（上海）股份有限公司]；葡萄糖、過硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、甲醇（均為西隴科學股份有限公司）；一氧化氮檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒（均為上海碧云天生物技術有限公司）；DMEM高糖細胞培養液（蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 3種可食用菌提取物的制備

1.2.1.1 3種可食用菌子實體提取

將銀耳、秀珍菇、猴頭菇的子實體剪碎，稱重，分別用95%乙醇和水進行超聲破碎。超聲破碎條件：破碎30 s、暫停30 s，功率90%，破碎總時長2 h。將破碎后的液體進行旋蒸濃縮，濃縮液經過冷凍干燥獲得子實體提取物，分別命名為水提銀耳（WET）、水提猴頭菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提銀耳（EET）、醇提猴頭菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.1.2 3種可食用菌菌絲體提取

將銀耳、秀珍菇、猴頭菇分別接種于改良的馬鈴薯葡萄糖固體培養基中，放置于25 ℃的恒溫培養箱內培養，待其長滿后，接種至液體發酵培養基中，放置25 ℃恒溫振蕩培養箱內振蕩培養1周，經紗布過濾將菌絲體與菌液分離，菌絲體稱重，分別用95%乙醇和水進行超聲破碎。超聲破碎條件：破碎30 s、暫停30 s、功率90%，破碎總時長2 h。將破碎后的液體進行旋蒸濃縮，濃縮液經過冷凍干燥獲得菌絲體提取物，分別命名為水提銀耳（WET）、水提猴頭菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提銀耳（EET）、醇提猴頭菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.2 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力試驗方法參照張啟貴等[16]的方法進行。取一定量ABTS加入適量蒸餾水中，將其配成7 mmol/L ABTS溶液。另取一定量過硫酸鉀加入蒸餾水，配成140 mmol/L過硫酸鉀溶液。

將440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液與25 mL 7 mmol/L ABTS溶液混合，避光反應12～16 h，用乙醇稀釋ABTS溶液至吸光度0.700±0.002。將樣品分別稀釋成不同的質量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），以維生素C作為陽性對照，取0.9 mL ABTS溶液與0.1 mL樣品混合，測定734 nm波長下的吸光度。ABTS自由基清除率（%）按式（1）計算。

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品試驗組吸光度。

1.2.3 金屬螯合能力的測定

金屬螯合能力參照歐陽吾樂等[17]的方法進行。將樣品分別稀釋成不同的質量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），陽性對照采用乙二胺四乙酸二鈉，依次加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.05 mL 2 mmol/L四水氯化亞鐵和1.8 mL甲醇，混合后避光反應10 min，測定562 nm波長下的吸光度。金屬螯合能力相對清除率（%）按式（2）計算。

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品試驗組吸光度。

1.2.4 NO清除能力測定

將樣品分別稀釋成不同的質量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），陽性對照采用維生素C。在EP管中依次加入120 μL樣品、120 μL亞硝酸鈉（0.02 μmol/L）、120 μL Griess Reagent1和120 μL Griess Reagent2，振蕩混合，避光反應10 min后在540 nm波長處測定吸光度。NO相對清除率（%）按式（3）計算。

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品試驗組吸光度。

1.2.5 細胞活性氧檢測

用含10%胎牛血清的培養液配成RAW264.7細胞懸液，接種到黑色96孔板，每孔體積100 μL，培養12 h。待細胞數量長到孔的80%左右時，每孔加入5 μL的樣品和87 μL含10%胎牛血清的培養液，培養24 h，加入400 μmol/L氧化氫作用4 h。

活性氧檢測試劑盒中的DCFH-DA按照1∶1 000的比例用無血清的細胞培養液稀釋初始DCFH-DA，使其終濃度為10 mol/L，將上述96孔板的培養液吸光，每孔加入100 μL稀釋后的DCFH-DA，在37 ℃ 5%二氧化碳培養箱中孵育20 min，用PBS緩沖液稀釋3次，在488 nm激發波長和525 nm發射波長下檢測其熒光強度。

1.2.6 細胞水平NO清除能力測定

用含10%胎牛血清的培養液配成RAW264.7細胞懸液，接種到96孔板，每孔體積100 μL，培養24 h。待細胞數量長到孔的80%左右時，每孔加入5 μL的樣品和93 μL的含10%胎牛血清的培養液，培養2 h，每孔加入2 μL的LPS（1 μg/mL），繼續培養24 h，每孔取50 μL上清液，加50 μL Griess Reagent1和50 μL Griess Reagent2，測定540 nm波長下的吸光度。細胞水平NO相對清除率（%）按式（4）計算。

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品試驗組吸光度。

1.3 數據處理與分析

每份樣品都進行3次的平行測定，測定結果取3次平行測定的平均值，用GraphPad Prism對結果進行作圖分析。試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用GraphPad Prism對結果進行作圖分析。組間兩兩比較采用最小顯著差異，用字母a、b、c、d表示其差異性，若字母相同則代表二者沒有顯著性差異，若字母不同則代表二者具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 ABTS自由基清除能力的測定

通過圖1（a）對水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物對ABTS自由基清除能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物對ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最強；醇提物中，醇提秀珍菇清除ABTS的能力大于醇提猴頭菇大于醇提銀耳。

圖1 不同濃度子實體（a）和菌絲體（b）提取物對ABTS陽離子自由基的清除率

通過圖1（b）對水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物對ABTS自由基清除能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物對ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最強，水提銀耳與水提猴頭菇次之；醇提物中，3種可食用菌的清除ABTS能力相當。這與商佳琦等[18]在分析5種食用真菌中銀耳以及猴頭菇抗氧化性的試驗結果基本吻合。

2.2 金屬螯合能力的測定

通過圖2（b）對水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物的金屬螯合能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物的金屬螯合能力也隨之降低，其中：水提物中，水提猴頭菇的金屬螯合能力最強，水提秀珍菇次之，水提銀耳最弱；醇提物中，3種可食用菌的金屬螯合能力不分伯仲。

圖2 不同濃度子實體（a）和菌絲體（b）提取物金屬螯合能力相對清除率

通過圖2（a）對水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物的金屬螯合能力進行分析，可以看出隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物的金屬螯合能力也隨之降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的金屬螯合能力最強，水提銀耳次之，水提猴頭菇最弱；醇提物中，醇提銀耳的金屬螯合能力最強，醇提猴頭菇次之，醇提秀珍菇最弱。

2.3 生化水平NO清除能力測定

通過圖3（a）對水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物生化水平清除NO能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物生化水平清除NO能力也隨之降低，只有水提銀耳有清除NO的能力。

圖3 不同濃度子實體（a）和菌絲體（b）提取物生化水平NO相對清除率

通過圖3（b）對水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物生化水平清除NO能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物生化水平清除NO能力也隨之降低，其中：水提物生化水平清除NO能力弱；醇提物生化水平清除NO能力比水提物強，且3種可食用菌菌絲體醇提取物生化水平清除NO能力不相上下。這與Zhang等[19]對于藥用真菌抗發炎能力的研究有著異曲同工之妙。

2.4 細胞活性氧檢測

通過圖4（a）對水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物作用細胞后，從其活性氧熒光強度分析可以看出，隨著可食用菌子實體提取物濃度的升高，熒光強度隨之降低，細胞內的活性氧也隨之降低。

圖4 不同濃度子實體（a）和菌絲體（b）提取物作用細胞的活性氧熒光強度

通過圖4（b）對水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物作用細胞后，從其活性氧熒光強度分析可以看出，隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的升高，熒光強度總體上呈也隨之降低，表明此3種食用菌的菌絲體提取物對活性氧有一定的清除效果。

2.5 細胞水平NO清除能力測定

通過圖5（a）對水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物細胞水平清除NO能力進行分析，可以看出隨著可食用菌子實體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物細胞水平清除NO能力總體上呈下降趨勢，水提和醇提的3種可食用菌子實體提取物細胞水平清除NO能力都較弱。

圖5 不同濃度菌絲體（a）和子實體（b）提取物細胞水平NO相對清除率

通過圖5（b）對水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物細胞水平清除NO能力進行分析，可以看出隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物細胞水平清除NO能力也隨之降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物都具有一定的細胞水平清除NO能力，且醇提物的效果要優于水提物的效果。

3 結論

提取3種均來自福建省古田縣的食用真菌，通過ABTS自由基清除試驗、金屬螯合能力測定試驗及細胞活性氧測定試驗，較全面地反映了水提或醇提的3種可食用菌子實體與菌絲體的抗氧化能力，無論是水提物還是醇提物，結果都表明秀珍菇的抗氧化能力最強。通過生化水平NO抑制試驗及細胞水平NO抑制試驗證明水提或醇提的3種可食用菌菌絲體與子實體的抗炎能力，結果表明水提與醇提的3種可食用菌子實體與菌絲體都具有一定抗炎效果，除了銀耳以外，其余2種可食用菌子實體與菌絲體的醇提物抗炎能力大于水提物。陳云波等[20]將銀耳多糖應用于化妝品的一系列工藝已經較為完備。由此可見這3種食用真菌特別是秀珍菇可作為潛在的天然抗氧化劑應用于藥品和食品工業中。若能進一步提純，這3種食用真菌提取物也可應用于抗炎的藥品和高端化妝品中。這些都為古田縣農產品的產業升級提供理論基礎。