乳桿菌發酵對茯苓的成分和抗氧化能力的影響

孟濤，冀利峰，杜川川，馬彪，曹剛剛

安徽古井健康科技有限公司（亳州 236800）

茯苓是我國傳統上既是食品又是藥品的物質之一[1]。茯苓具有利水滲濕、健脾、寧心之功效[2]。茯苓具有多種活性成分，包括但不限于多糖類、三萜類、甾醇類及其衍生物[3-5]。現代醫學研究發現，茯苓多糖和三萜在抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、抗炎等方面具有一定作用[6-9]。關于茯苓中總黃酮和多酚的相關研究文獻報道較少。

微生物發酵技術特異性強、副產物少、條件溫和而且清潔環保，因此在中藥轉化領域具有獨特優勢[10-11]。而作為發酵核心的益生菌又起著決定性作用[12]。基于中藥材原料的特殊性，探究不同菌株對原料的發酵性能，并篩選適宜特定中藥發酵的益生菌，具有重要的科學意義和應用價值[13-14]。

以茯苓為研究對象，利用實驗室保藏的三株對植物性原料耐受性強、發酵轉化率高的乳桿菌進行發酵，通過檢測茯苓發酵前后的主要活性成分和抗氧化性，即總黃酮、總酚、總三萜的含量和ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率的變化，對益生菌發酵在食藥兩用茯苓深加工中的應用進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓、白砂糖（市售）；植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2、鼠李糖乳桿菌YS-3（經過選育的適宜植物類原料發酵的菌種，保藏于實驗室）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；蘆丁[純度≥95%，生工生物工程（上海）股份有限公司]；維生素C（L-抗壞血酸，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；ABTS+、DPPH、沒食子酸、福林-酚、無水乙醇、香草醛、齊墩果酸、冰乙酸、高氯酸、過氧化氫（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

Infinite F50酶標儀（瑞士TECAN公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；DK-S28電熱恒溫水浴鍋、DNP-9162電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DK-8D三溫三控水槽、YXQ-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SW-CJ-1D凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

挑選干燥、無霉變的茯苓塊，除去雜質，自來水沖洗后用無菌水洗凈，勻漿，紗布過濾汁液用于發酵。稱取500.0 g茯苓汁置于無菌密封罐中，加入5%白砂糖，攪拌溶解，于121 ℃滅菌15 min，接種5%乳桿菌菌種液（1×108CFU/mL），于37 ℃密封恒溫發酵7 d，每隔2 d放氣1次，發酵結束后過濾得濾液，按6 000 r/min離心15 min，獲得上清液，備用。取上清液，調整pH至中性，稀釋到適宜濃度用于自由基清除率的檢測分析。相關發酵工藝條件的優化在前期研究已完成。

1.3.2 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[15]建立標準曲線和樣品檢測，以蘆丁為標準品，檢測波長510 nm，標準曲線方程為y=1.496 2x+0.001 4，R2=0.999 7。根據樣品檢測的吸光度得出樣品中總黃酮的蘆丁當量。

1.3.3 總酚含量的測定

采用福林-酚法[16]。檢測波長760 nm，沒食子酸標準曲線方程為y=0.001 1x+0.005 2，R2=0.999 5。根據樣品檢測的吸光度得出總酚的沒食子酸當量。

1.3.4 總三萜含量的測定

采用高氯酸-香草醛比色法[16]測定總三萜含量。以齊墩果酸為標準品，檢測波長550 nm，標準曲線方程為y=12.435 2x-0.041 3，R2=0.998 8。根據齊墩果酸標準曲線計算出樣品中總三萜含量。

1.3.5 ABTS+自由基清除率的測定

參照謝國芳等[17]的測定方法，檢測波長734 nm，維生素C作陽性對照，按式（1）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A1為樣品加ABTS+工作液反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率的測定

參照譚榮華等[18]的測定方法，檢測波長510 nm。以維生素C作為陽性對照。羥自由基清除率的計算參照式（2）。

式中：A1為樣品加H2O2反應體系反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

采用比色法測定[19]，檢測波長517 nm。以維生素C作為陽性對照。DPPH自由基清除率的計算參照式（3）。

式中：A1為樣品加DPPH溶液反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.8 數據統計分析

所有試驗做3個平行，數據采用平均值表示。取得各項檢測數據后采用Origin 8.0軟件繪圖，采用SPSS 20.0軟件進行數據顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量的變化

如圖1所示，茯苓漿（即對照，下同）發酵前總黃酮含量均值為2.4 g/L，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液總黃酮含量分別達到4.2，3.7和3.1 g/L，均有顯著提升（P＜0.05）。特別是經植物乳桿菌YS-1發酵的茯苓總黃酮含量比發酵前提高75%。

圖1 乳桿菌發酵前后的總黃酮含量變化情況

2.2 總酚含量的變化

如圖2所示，茯苓漿發酵前總酚含量為4.2 g/L，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液的總酚含量分別達到6.5，6.2和5.8 g/L，均有顯著提升（P＜0.05）。經植物乳桿菌YS-1發酵的茯苓總酚含量比發酵前提高55%。

圖2 乳桿菌發酵前后的總酚含量變化情況

2.3 總三萜含量的變化

如圖3所示，茯苓漿發酵前總三萜含量為5.5 g/L，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液的總三萜含量分別為7.9，6.8和4.3 g/L，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2發酵的茯苓總三萜含量顯著提升（P＜0.05），經鼠李糖乳桿菌YS-3發酵后總三萜含量下降。其中，經植物乳桿菌YS-1發酵后提升幅度達到44%。綜上，在3株乳桿菌中，植物乳桿菌YS-1對茯苓的抗氧化成分發酵性能最佳。

圖3 乳桿菌發酵前后的總三萜含量變化情況

2.4 ABTS+自由基清除率的變化

如圖4所示，茯苓漿發酵前對ABTS+自由基清除率為62%，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液對ABTS+自由基清除率分別為77%，81%和69%。其中，經植物乳桿菌YS-2發酵后對ABTS+自由基清除率最高，稍高于植物乳桿菌YS-1。

圖4 乳桿菌發酵前后的ABTS+自由基清除率變化情況

2.5 羥自由基清除率的變化

如圖5所示，茯苓漿發酵前對羥自由基清除率為68%，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液對羥自由基的清除率分別為75%，77%和62%。其中，經植物乳桿菌YS-2發酵的茯苓漿對羥自由基清除率稍高于植物乳桿菌YS-1。經鼠李糖乳桿菌YS-3發酵的茯苓漿對羥自由基清除率稍有下降。

圖5 乳桿菌發酵前后的羥自由基清除率變化情況

2.6 DPPH自由基清除率的變化

如圖6所示，茯苓漿發酵前對DPPH自由基清除率為55%，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發酵后，發酵液對DPPH自由基的清除率分別為88%，72%和62%。經植物乳桿菌YS-1發酵后顯著提升，比發酵前提高33%。綜上，植物乳桿菌YS-1和YS-2發酵茯苓可顯著提高其對3種自由基的清除率。

圖6 乳桿菌發酵前后的DPPH自由基清除率變化情況

3 結論

試驗研究了茯苓經乳桿菌發酵前后的抗氧化成分和抗氧化能力的變化。經檢測，茯苓原漿的總黃酮、總酚、總三萜含量分別為2.4，4.2和5.5 g/L，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2分別發酵后，3種成分含量均顯著提高。經植物乳桿菌YS-1發酵后的總黃酮、總酚、總三萜含量均最高，分別達到4.2，6.5和7.9 g/L。抗氧化成分的含量顯著提升。茯苓原漿對ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率分別為62%，68%和55%，經植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2分別發酵后，發酵液對3種自由基清除能力比發酵前均有明顯提高。平均而言，植物乳桿菌YS-1發酵后提升更明顯。ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率分別達到77%，75%和88%。經鼠李糖乳桿菌YS-3發酵后的茯苓總三萜含量下降，且對羥自由基清除率也稍有降低。試驗表明3株乳桿菌發酵的茯苓特征成分含量和抗氧化性具有較大差異。植物乳桿菌YS-1發酵對提升茯苓抗氧化成分含量和自由基清除率最佳。