奶糖、巧克力三聚氰胺基質效應的研究和消除

劉超，呂雪梅，景贊

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，俗稱蛋白精、密胺，常被用作化工原料，不可用作食品添加劑[1-3]。其主要用途是作為原料生產三聚氰胺甲醛樹脂。人和動物長期食用含有三聚氰胺的食物可能會導致腎衰竭或死亡[4]。然而常有不法分子為降低食品生產成本，利用蛋白質檢測技術缺陷在部分食品中添加三聚氰胺。

液質聯用技術是一種分離檢測技術，具有選擇性高、定性能力強、分析速度快，高分離效能以及高靈敏度的特點[5-9]。近年來，液質聯用技術在食品中三聚氰胺的檢測得到廣泛應用。

然而由于基質效應的存在，影響待測物在檢測儀器中的響應，導致待測物的響應減弱或增強，進一步影響待測物的定量限、檢出限、精確度及準確度等[10-13]。因此，探究并消除在利用液質聯用技術對奶糖、巧克力檢測三聚氰胺時基質效應的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質聯用儀（美國AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創科技有限公司）；VM24固相萃取儀（天津艾杰爾科技有限公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（長州冠軍儀器制造頭有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；60 mg/3 mL固相萃取柱（天津艾杰爾科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）；三氯乙酸、氨水、乙酸銨、海沙（含量25%～28%），均為分析純；三聚氰胺標準品（99.4%，批號G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；水（GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定一級水）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL 壇墨質檢科技股份有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

奶糖樣品：旺仔牛奶糖、錦大手工牛軋糖、不二家香酥牛奶糖、葡記蔓越莓味咸牛軋糖、大白兔奶糖、阿爾卑斯牛奶硬糖、徐福記散裝奶糖、金絲猴奶糖。

巧克力樣品：德芙、士力架、雀巢、徐福記、金絲猴、金莎、金帝、申豐。

具塞塑料離心管（50 mL）；研缽；定性濾紙；SPE小柱（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）。

1.3 樣品處理

提取、凈化方法分別參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[14]。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10.00 mg（精確到0.01 mg）三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成質量濃度1 mg/mL的標準儲備液，在4 ℃避光的條件下保存。

1.5 三聚氰胺標準液及內標中間液

三聚氰胺標準中間液：準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后貼標簽備用。

三聚氰胺內標中間液：準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后貼標簽備用。

1.6 液相色譜-質譜/質譜測定

液相色譜條件、質譜條件參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》。

1.7 基質效益評價方法

運用定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應程度，通過式（1），計算二者比值評價基質效應。

式中：A和B為基質溶液和純溶劑分析物的峰面積。A/B＜80%時，對分析物的響應產生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質效應。

1.8 統計分析

所有數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 取樣量對基質效應的影響

分別稱取0.50 g奶糖和1.00 g巧克力樣品，按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數據，并按照1.8進行統計分析。結果見表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對奶糖中三聚氰胺基質效應的影響

圖2 取樣量對巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

表1 取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

由表1可知，取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖1可知，改變取樣量，奶糖中三聚氰胺的基質效應分別在27.4%～36.0%和17.1%～25.3%。由圖2可知，改變取樣量，巧克力中三聚氰胺的基質效應分別在26.3%～38.5%和18.0%～29.6%。

2.2 溶劑種類對基質效應的影響

分別稱取等量的4份奶糖和巧克力樣品，第1份用10 mL水作為溶劑，第2份用6 mL乙腈和4 mL水（即V乙腈∶V水=3∶2）作為溶劑，第3份用10 mL純三氯乙酸作為溶劑，第4份用8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈（即V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1）作為溶劑，按照1.3樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數據，并按照1.8進行統計分析。結果見表2，圖3和圖4。

圖3 溶劑種類對奶糖中三聚氰胺基質效應的影響

圖4 溶劑種類對巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

表2 溶劑種類對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

由表2可知，溶劑水和乙腈-水（3∶2，V/V）對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖3可知，通過改變溶劑種類測得奶糖中三聚氰胺的基質效應分別在32.8%～44.7%，25.9%～37.8%，19.2%～30.7%和17.3%～29.2%之間。由圖4可知，通過改變溶劑種類，測得巧克力中三聚氰胺的基質效應分別在32.3%～42.1%，25.9%～34.6%，19.2%～27.0%和16.8%～24.4%之間。

2.3 溶劑用量對基質效應的影響

分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品，統一選用三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）作為溶劑，第一份加入4 mL三氯乙酸和1 mL乙腈（即溶劑用量5 mL），第2份加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈（即溶劑用量為10 mL），第3份加入12 mL三氯乙酸和3 mL乙腈（即溶劑用量15 mL），按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數據，并按照1.8進行統計分析。結果見表3，圖5和圖6。

圖5 溶劑用量對奶糖中三聚氰胺基質效應的影響

圖6 溶劑用量對巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

表3 溶劑用量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

由表3可知，溶劑用量對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖5可知，通過改變溶劑用量，測得奶糖中三聚氰胺的基質效應分別在24.7%～32.0%，17.8%～25.8%和14.6%～25.8%之間。由圖6可知，改變溶劑用量，測得巧克力中三聚氰胺的基質效應分別為24.0%～35.4%，18.5%～30%和15.0%～26.4%之間。

2.4 不同濃度的三聚氰胺對基質效應的影響

分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品，參照1.3的方法進行提取和凈化。處理后的3份樣品中分別加入10 ng/mL三聚氰胺儲備液、50 ng/mL三聚氰胺儲備液和100 ng/mL三聚氰胺儲備液，按照1.6的方法進行測量并記錄數據，并按照1.8進行統計分析。結果見表4，圖7和圖8。

圖7 三聚氰胺濃度對奶糖中三聚氰胺基質效應的影響

圖8 三聚氰胺濃度對巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

表4 三聚氰胺濃度對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

由表4可知，三聚氰胺濃度對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖7可知，改變三聚氰胺濃度奶糖中三聚氰胺的基質效應分別在17.0%～24.2%，18.5%～30.0%和15.0%～26.4%之間。由圖8得知，改變三聚氰胺濃度巧克力，三聚氰胺的基質效應分別在18.7%～31.8%，19.7%～31.8%和20.0%～30.9%之間。

2.5 凈化方式對基質效應的影響

分別稱取4份等量的奶糖和巧克力樣品，參照1.3的方法進行樣品處理，第1份樣品不過柱，第2份樣品過WCX SPE小柱，第3份樣品過Cleanert PCX SPE小柱，第4份樣品過Bond Elut Plexa PCX SPEX小柱，按照1.6的方法進行測量并記錄數據，并按照1.8進行統計分析。結果見表5，圖9和圖10。

圖9 凈化方式對奶糖中三聚氰胺基質效應的影響

圖10 凈化方式對巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

表5 SPE小柱對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質效應的影響

由表5可知，不過SPE小柱和過不同小柱之間對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。而過不同SPE小柱之間沒有顯著性差異。由圖9可知，通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCXSPE小柱奶糖，三聚氰胺的基質效應分別在11.7%～26.0%，17.5%～25.9%，19.7%～31.8%和18.8%～24.8%之間。由圖10可知，通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX小柱而測得巧克力中三聚氰胺的基質效應分別在12.1%～24.0%，17.3%～29.2%，18.1%～27.9%和19.2%～28.3%之間。

2.6 基質效應的消除

取空白樣品按照1.3的方法處理。用空白溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋，得到質量濃度為10.00，20.00，40.00，80.00，160.00和200.00 ng/mL的標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺的內標質量濃度20 ng/mL。將濃度由低到高進樣檢測，橫坐標為三聚氰胺濃度、縱坐標為三聚氰胺峰面積/內表峰面積，得到標準曲線回歸方程，見表6。

表6 三聚氰胺標準曲線

稱量9個空白樣品至9個50 mL的具塞塑料離心管中，加入相同體積的20.00 μL內標中間溶液，然后分別加入25.00，50.00和100.00 μL三聚氰胺標準中間溶液，做三水平三平行回收試驗，按照1.3的方法提取和凈化處理，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內標峰面積，計算加標回收率。

由表7和表8可得，隨著加標濃度的變化，回收率都在97.18%～110.5%之間，內標法對三聚氰胺基質效應的消除具有非常顯著的效果，徹底消除基質效應，達到理想的效果。

表7 奶糖樣品加標回收率（n=3）

表8 巧克力樣品加標回收率（n=3）

3 結論

從樂山市場任意選取8種奶糖和8種巧克力，通過液質聯用對其進行三聚氰胺基質效應的探究，并通過單因素方差分析探究了取樣量、溶劑種類、溶劑用量、三聚氰胺濃度及SPE小柱對檢測三聚氰胺基質效應的影響是否顯著。試驗結果表明取樣量、溶劑種類[除三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）]、溶劑用量及不過SPE小柱對三聚氰胺基質效應的檢測都具有顯著性差異，而三聚氰胺濃度和SPE小柱的類型以及溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）對三聚氰胺基質效應的檢測沒有顯著性差異。通過內標法有效消除三聚氰胺基質效應的影響。