奶糖、巧克力三聚氰胺基質(zhì)效應的研究和消除

劉超，呂雪梅，景贊

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，俗稱蛋白精、密胺，常被用作化工原料，不可用作食品添加劑[1-3]。其主要用途是作為原料生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂。人和動物長期食用含有三聚氰胺的食物可能會導致腎衰竭或死亡[4]。然而常有不法分子為降低食品生產(chǎn)成本，利用蛋白質(zhì)檢測技術缺陷在部分食品中添加三聚氰胺。

液質(zhì)聯(lián)用技術是一種分離檢測技術，具有選擇性高、定性能力強、分析速度快，高分離效能以及高靈敏度的特點[5-9]。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術在食品中三聚氰胺的檢測得到廣泛應用。

然而由于基質(zhì)效應的存在，影響待測物在檢測儀器中的響應，導致待測物的響應減弱或增強，進一步影響待測物的定量限、檢出限、精確度及準確度等[10-13]。因此，探究并消除在利用液質(zhì)聯(lián)用技術對奶糖、巧克力檢測三聚氰胺時基質(zhì)效應的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；HSC-12A氮吹儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）；VM24固相萃取儀（天津艾杰爾科技有限公司）；HT190R高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（長州冠軍儀器制造頭有限公司）；KQ3200E超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；60 mg/3 mL固相萃取柱（天津艾杰爾科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇（均為色譜純）；三氯乙酸、氨水、乙酸銨、海沙（含量25%～28%），均為分析純；三聚氰胺標準品（99.4%，批號G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；水（GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定一級水）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

奶糖樣品：旺仔牛奶糖、錦大手工牛軋?zhí)恰⒉欢蚁闼峙Ｄ烫恰⑵嫌浡捷断膛＼執(zhí)恰⒋蟀淄媚烫恰柋八古Ｄ逃蔡恰⑿旄Ｓ浬⒀b奶糖、金絲猴奶糖。

巧克力樣品：德芙、士力架、雀巢、徐福記、金絲猴、金莎、金帝、申豐。

具塞塑料離心管（50 mL）；研缽；定性濾紙；SPE小柱（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）。

1.3 樣品處理

提取、凈化方法分別參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[14]。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10.00 mg（精確到0.01 mg）三聚氰胺標準品于10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的標準儲備液，在4 ℃避光的條件下保存。

1.5 三聚氰胺標準液及內(nèi)標中間液

三聚氰胺標準中間液：準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后貼標簽備用。

三聚氰胺內(nèi)標中間液：準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后貼標簽備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定

液相色譜條件、質(zhì)譜條件參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》。

1.7 基質(zhì)效益評價方法

運用定量測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應程度，通過式（1），計算二者比值評價基質(zhì)效應。

式中：A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。A/B＜80%時，對分析物的響應產(chǎn)生抑制作用；A/B＞120%，對分析物的響應產(chǎn)生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應。

1.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對基質(zhì)效應的影響

分別稱取0.50 g奶糖和1.00 g巧克力樣品，按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù)，并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

圖2 取樣量對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

表1 取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

由表1可知，取樣量對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖1可知，改變?nèi)恿浚烫侵腥矍璋返幕|(zhì)效應分別在27.4%～36.0%和17.1%～25.3%。由圖2可知，改變?nèi)恿浚煽肆χ腥矍璋返幕|(zhì)效應分別在26.3%～38.5%和18.0%～29.6%。

2.2 溶劑種類對基質(zhì)效應的影響

分別稱取等量的4份奶糖和巧克力樣品，第1份用10 mL水作為溶劑，第2份用6 mL乙腈和4 mL水（即V乙腈∶V水=3∶2）作為溶劑，第3份用10 mL純?nèi)纫宜嶙鳛槿軇?份用8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈（即V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1）作為溶劑，按照1.3樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù)，并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表2，圖3和圖4。

圖3 溶劑種類對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

圖4 溶劑種類對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

表2 溶劑種類對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

由表2可知，溶劑水和乙腈-水（3∶2，V/V）對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖3可知，通過改變?nèi)軇┓N類測得奶糖中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別在32.8%～44.7%，25.9%～37.8%，19.2%～30.7%和17.3%～29.2%之間。由圖4可知，通過改變?nèi)軇┓N類，測得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別在32.3%～42.1%，25.9%～34.6%，19.2%～27.0%和16.8%～24.4%之間。

2.3 溶劑用量對基質(zhì)效應的影響

分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品，統(tǒng)一選用三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）作為溶劑，第一份加入4 mL三氯乙酸和1 mL乙腈（即溶劑用量5 mL），第2份加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈（即溶劑用量為10 mL），第3份加入12 mL三氯乙酸和3 mL乙腈（即溶劑用量15 mL），按照1.3的樣品處理方法進行提取和凈化，按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù)，并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表3，圖5和圖6。

圖5 溶劑用量對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

圖6 溶劑用量對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

表3 溶劑用量對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

由表3可知，溶劑用量對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。由圖5可知，通過改變?nèi)軇┯昧浚瑴y得奶糖中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別在24.7%～32.0%，17.8%～25.8%和14.6%～25.8%之間。由圖6可知，改變?nèi)軇┯昧浚瑴y得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別為24.0%～35.4%，18.5%～30%和15.0%～26.4%之間。

2.4 不同濃度的三聚氰胺對基質(zhì)效應的影響

分別稱取3份等量的奶糖和巧克力樣品，參照1.3的方法進行提取和凈化。處理后的3份樣品中分別加入10 ng/mL三聚氰胺儲備液、50 ng/mL三聚氰胺儲備液和100 ng/mL三聚氰胺儲備液，按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù)，并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表4，圖7和圖8。

圖7 三聚氰胺濃度對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

圖8 三聚氰胺濃度對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

表4 三聚氰胺濃度對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

由表4可知，三聚氰胺濃度對檢測奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME不存在顯著性差異。由圖7可知，改變?nèi)矍璋窛舛饶烫侵腥矍璋返幕|(zhì)效應分別在17.0%～24.2%，18.5%～30.0%和15.0%～26.4%之間。由圖8得知，改變?nèi)矍璋窛舛惹煽肆Γ矍璋返幕|(zhì)效應分別在18.7%～31.8%，19.7%～31.8%和20.0%～30.9%之間。

2.5 凈化方式對基質(zhì)效應的影響

分別稱取4份等量的奶糖和巧克力樣品，參照1.3的方法進行樣品處理，第1份樣品不過柱，第2份樣品過WCX SPE小柱，第3份樣品過Cleanert PCX SPE小柱，第4份樣品過Bond Elut Plexa PCX SPEX小柱，按照1.6的方法進行測量并記錄數(shù)據(jù)，并按照1.8進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表5，圖9和圖10。

圖9 凈化方式對奶糖中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

圖10 凈化方式對巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

表5 SPE小柱對奶糖、巧克力中三聚氰胺基質(zhì)效應的影響

由表5可知，不過SPE小柱和過不同小柱之間對奶糖、巧克力中三聚氰胺的ME存在顯著性差異。而過不同SPE小柱之間沒有顯著性差異。由圖9可知，通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCXSPE小柱奶糖，三聚氰胺的基質(zhì)效應分別在11.7%～26.0%，17.5%～25.9%，19.7%～31.8%和18.8%～24.8%之間。由圖10可知，通過改變不過SPE小柱和過WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX小柱而測得巧克力中三聚氰胺的基質(zhì)效應分別在12.1%～24.0%，17.3%～29.2%，18.1%～27.9%和19.2%～28.3%之間。

2.6 基質(zhì)效應的消除

取空白樣品按照1.3的方法處理。用空白溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度為10.00，20.00，40.00，80.00，160.00和200.00 ng/mL的標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺的內(nèi)標質(zhì)量濃度20 ng/mL。將濃度由低到高進樣檢測，橫坐標為三聚氰胺濃度、縱坐標為三聚氰胺峰面積/內(nèi)表峰面積，得到標準曲線回歸方程，見表6。

表6 三聚氰胺標準曲線

稱量9個空白樣品至9個50 mL的具塞塑料離心管中，加入相同體積的20.00 μL內(nèi)標中間溶液，然后分別加入25.00，50.00和100.00 μL三聚氰胺標準中間溶液，做三水平三平行回收試驗，按照1.3的方法提取和凈化處理，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內(nèi)標峰面積，計算加標回收率。

由表7和表8可得，隨著加標濃度的變化，回收率都在97.18%～110.5%之間，內(nèi)標法對三聚氰胺基質(zhì)效應的消除具有非常顯著的效果，徹底消除基質(zhì)效應，達到理想的效果。

表7 奶糖樣品加標回收率（n=3）

表8 巧克力樣品加標回收率（n=3）

3 結(jié)論

從樂山市場任意選取8種奶糖和8種巧克力，通過液質(zhì)聯(lián)用對其進行三聚氰胺基質(zhì)效應的探究，并通過單因素方差分析探究了取樣量、溶劑種類、溶劑用量、三聚氰胺濃度及SPE小柱對檢測三聚氰胺基質(zhì)效應的影響是否顯著。試驗結(jié)果表明取樣量、溶劑種類[除三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）]、溶劑用量及不過SPE小柱對三聚氰胺基質(zhì)效應的檢測都具有顯著性差異，而三聚氰胺濃度和SPE小柱的類型以及溶劑三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）對三聚氰胺基質(zhì)效應的檢測沒有顯著性差異。通過內(nèi)標法有效消除三聚氰胺基質(zhì)效應的影響。