谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對酒精性肝損傷的保護作用

孫錦，張小麗，王瑩瑩，唐銅，程倩，陳智仙

1. 酵母功能湖北省重點實驗室（宜昌 443000）；2. 宜昌市營養健康食品工程技術研究中心（宜昌 443000）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸縮合而成的三肽化合物，大量存在于酵母、小麥胚芽、動物和人體肝臟、腎臟及紅細胞中[1]。GSH主要以還原型形態存在于真核細胞，約90%分布于胞漿，還有少量分布在線粒體、內質網及細胞核[2]，其極易被氧化為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），因此對維持細胞內正常的氧化還原環境具有重要作用[3]。藥理學研究證實谷胱甘肽具有抗氧化[4]、解毒[5]、調控免疫[6]等作用，臨床上用于治療或輔助治療肝臟疾病[7]、胰腺疾病[8]、腎臟疾病[9]、帕金森病[10]、急性心肌梗死[11]等。硒是生物體所必需的微量營養元素之一，其作為谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）的活性中心，在清除體內活性氧自由基方面有重要作用[12]。酵母具有較高的富硒能力，能將無機硒轉化為有機硒，降低無機硒的毒性、提高生物利用度。另外，除了補充硒元素外，富硒酵母還能同時提供豐富的B族維生素、優質蛋白質、氨基酸等營養物質[13]。已有研究表明富硒酵母具有預防腫瘤[14]、降血糖[15]、降血脂[16]、降血壓[17]、增強人體免疫力[18]等諸多功效。

我國酒文化源遠流長，無酒不成席的飲食習俗也導致酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是我國常見的肝臟疾病之一，并且發病年齡逐漸年輕化。肝實質細胞是乙醇代謝的主要場所，長期或過量飲酒使得肝實質細胞一直受到乙醇及其代謝產物的刺激，從而誘導線粒體損傷、內質網應激，活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積、脂肪堆積等，最終導致肝細胞損傷[19]。已有研究證實谷胱甘肽能明顯改善酒精性肝損傷，促進酒精性肝病的恢復[20]。此外，有研究指出富硒酵母對化學性肝損傷具有保護作用[21]。然而，谷胱甘肽和富硒酵母聯合對酒精性肝損傷的保護作用尚鮮見報道。因此，試驗將谷胱甘肽與富硒酵母混合制得谷胱甘肽富硒酵母復合制劑，通過小鼠試驗研究其對酒精性肝損傷的保護作用，為保健食品的開發與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

谷胱甘肽富硒酵母復合制劑（安琪酵母股份有限公司），成人體重按60 kg計算，折合人體推薦量為0.016 7 g/（kg·Bw）。

1.2 儀器及試劑

T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BS-420全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；RM2235切片機（德國Leica公司）；YABO-400組織包埋機（常州雅博電子設備有限公司）；HD-330攤片烤片機（湖北慧達儀器有限公司）。

丙二醛（MDA）測定試劑盒、還原型GSH測定試劑盒、甘油三酯（TG）測定試劑盒、無水乙醇（分析純）、甲醛等。

1.3 試驗動物

由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供的S P F 級昆明種雄性小鼠5 0 只（質量合格證號61001700003135），體重18～22 g，生產許可證號SCXK（陜）2018-001。試驗動物房為屏障系統，使用許可證號SYXK（陜）2018-009，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%。動物飼料、墊料均由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

分別稱取0.50，0.33和0.17 g樣品，依次加蒸餾水至20 mL，混合混勻，分別配成濃度為2.50%，1.65%和0.85%的混懸液，備用。

1.4.2 動物分組及處理

隨機將雄性小鼠分為5組，每組10只，分別為陰性對照組、模型對照組及高、中、低3個劑量組。3個劑量組分別給予0.50，0.33和0.17 g/（kg·Bw）的樣品（相當于人體每日推薦量的30，20和10倍），陰性對照組和模型對照組給予同等體積的蒸餾水，按20 mL/（kg·Bw）每天經口灌胃1次。每周稱2次體重，以此調整受試樣品灌胃體積。在試驗第30天時將模型對照組和3個劑量組，一次經口灌胃50%乙醇溶液，劑量為12 mL/（kg·Bw），陰性對照組給予同體積的蒸餾水，禁食不禁水16 h后稱終體重，頸椎脫臼處死。

1.4.3 小鼠肝臟組織生化指標的檢測

取0.50 g處死后小鼠的肝臟，按1∶9 g/mL加入生理鹽水，勻漿后按3 000 r/min離心10 min，取上清液，制得10%肝勻漿，然后按照試劑盒要求進行各項指標（MDA、還原型GSH、TG）的檢測。

1.4.4 小鼠肝臟組織病理學診斷

將各組動物肝臟從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹Ⅲ染色。在光學顯微鏡下采用40倍物鏡從肝臟的一端視野開始連續觀察整個染色組織切片，主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積，分別記錄每個視野中的各種病變所占視野的面積，累計所有視野觀察情況，根據評分標準分別對樣品的肝臟脂質蓄積情況進行評分，以此評估肝細胞損傷程度。詳細評分標準如表1所示。

1.4.5 試驗數據統計

采用Minitab軟件對數據進行統計分析，試驗數據以平均值±標準偏差（SD）表示。采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）測定統計學顯著性，P＜0.05被認定為組間具有統計學意義上的顯著差異。

1.5 評定標準

在酒精性肝損傷模型成立的前提下，肝臟MDA、還原型GSH和TG這3項檢測指標結果陽性，或者肝臟MDA、還原型GSH和TG這3項指標中任2項指標陽性和病理組織學檢查結果陽性，滿足以上任一條件，可判定受試樣品具有對酒精性肝損傷有輔助保護作用。

2 結果與分析

2.1 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對小鼠體重的影響

試驗期間，各組小鼠生長發育良好，飲食飲水正常。通過對各組小鼠體重的檢測發現（表2），谷胱甘肽富硒酵母復合制劑各劑量組與陰性對照組比較，小鼠的體重增長無顯著變化（P＞0.05），表明谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對小鼠體重無影響，可初步判斷谷胱甘肽富硒酵母復合制劑具有一定安全性。另外，模型對照組小鼠與陰性對照組比較，體重增長也無顯著變化（P＞0.05），排除體重對結果的影響。

表2 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對各組試驗小鼠體重的影響

2.2 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對小鼠肝勻漿中MDA、還原型GSH、TG含量的影響

在試驗第30天按照12 mL/（kg·Bw）的劑量給予模型對照組和陰性對照組小鼠50%乙醇，以此建立急性酒精性肝損傷模型。由圖1所示，與陰性對照組比較，模型對照組小鼠肝組織中MDA值升高，還原型GSH值降低，TG值升高，差異均有極顯著性（P＜0.01），說明試驗模型成立。由圖1（a）所示，與模型對照組比較，各劑量組小鼠肝組織中MDA值均無明顯降低，差異均無顯著性（P＞0.05）。由圖1（b）所示，相比于模型對照組，高劑量小鼠組肝組織中還原型GSH值升高，差異有極顯著性（P＜0.01）。由圖1（c）所示，相比于模型對照組，高劑量組小鼠肝組織中TG值降低，差異有顯著性（P＜0.05）。由此判定還原型GSH和TG值2項指標結果均為陽性。

圖1 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對肝組織中MDA（a）、還原型GSH（b）、TG（c）含量的影響

2.3 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對小鼠肝臟病理組織學的影響

觀察各組小鼠肝組織病理切片，以肝臟脂質蓄積情況進行評分。由表3可見，模型對照組與陰性對照組比較，肝臟脂肪細胞變性評分在統計學上有顯著性差異（P＜0.01），說明小鼠酒精性肝損傷模型造模成功。與模型組比較，各劑量組肝細胞脂肪變性程度均減輕，高、中劑量組與模型對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。病理組織學指標可判斷為陽性。

表3 谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對小鼠肝臟組織病理學的影響

3 結論

肝實質細胞是乙醇代謝的主要場所，乙醇被細胞質中的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成醛類，進入線粒體，在乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的作用下還原為乙酸，從而排出體外起到解毒作用[22]。在乙醇代謝的過程中，會產生大量ROS。長期和/或大量飲酒使得ROS蓄積，造成氧化應激，導致蛋白質損傷、DNA損傷、脂肪變性、炎癥反應等，最終造成嚴重的肝損傷[23]。過量的ROS與生物膜不飽和脂肪酸作用，產生脂質過氧化物，引起MAD含量升高，因此MAD含量能間接反映肝細胞膜的受損程度[24]。另外，ROS的增加量也遠高于還原型GSH等抗氧化劑的量，將消耗體內的還原型GSH，使還原型GSH含量降低[25]。同時乙醇的攝入通過下調腺苷酸活化蛋白激酶或內質網應激反應間接刺激固醇調節元件結合蛋白的表達，增強多種脂肪酶的合成，從而促進TG的合成并在肝臟中沉積，使其含量不斷升高[26-27]。

試驗中，通過測定比較不同組別小鼠肝組織中的MDA、還原型GSH、TG的含量，評估酒精肝損傷模型的建立效果，以及受試樣品對肝臟的保護作用。將模型對照組與陰性對照組比較，其MDA值升高，還原型GSH值降低，TG值升高，且具有極顯著性差異，說明試驗中酒精性肝損傷的模型建立成功，試驗方法可靠。與模型對照組比較，受試樣品高劑量組的還原型GSH值顯著升高，TG值顯著降低，說明該受試樣品具有降低酒精性肝損傷小鼠肝臟TG含量，并升高還原型GSH含量的作用。同時，通過觀察肝臟組織病理變化，結果發現與陰性對照組比較，模型對照組的肝組織病變嚴重，肝臟脂肪細胞變性評分顯著升高，進一步驗證酒精肝損傷模型建立成功。而與模型對照組比較，受試樣品各劑量組肝細胞脂肪變性程度均減輕，且高、中劑量組有顯著性差異，說明該受試樣品能保護小鼠肝臟細胞，減輕脂肪變性。試驗結果證實，谷胱甘肽富硒酵母復合制劑對酒精性肝損傷具有輔助保護作用。