嬰幼兒配方乳粉中生物素的測定能力驗證結果分析

陰甜甜，張璐，張瑩瑩，李軻

1. 河南德仕人力資源服務有限公司（鄭州 450003）；2. 鄭州海關技術中心（鄭州 450003）

生物素（Biotin）又被稱為維生素B7、維生素H、輔酶R（Coenzyme R）等，是一種人體無法自身合成、機體機能所必需的水溶性B族維生素，長期缺乏會導致一系列的缺乏癥，常以皮膚、黏膜和神經系統損害為主[1-2]。尤其是嬰幼兒腸道功能較弱，缺乏生物素容易患皮炎、舌炎，甚至引起嚴重的神經癥狀，所以，常在嬰幼兒食品中添加生物素[3]。我國對食品標簽有嚴格規定，標準中要求在產品有效期內，營養成分與能量的實際含量要高于標示值的80%[4]。生物素作為嬰幼兒乳粉中重要添加物質，是我國重點監管對象。

能力驗證是指借助實驗室之間的對比判斷其檢測、校準等能力，是判斷和監控實驗室技術能力、改進質量管理體系的有效手段，是重要的實驗室外部質量控制方法[5]。通過能力驗證可以讓各個實驗室發現自身存在的問題，對實驗室人員能力的評價、數據與結果準確性的評價、方法的驗證等都有很大意義。CNAS-RL02：2018《能力驗證規則》中規定：食品微生物領域的能力驗證最低參加頻次為1次/年以上[6]。

為檢測實驗室是否掌握配方乳粉中生物素的檢測能力，實驗室參加市場監管總局組織的嬰幼兒配方乳粉中生物素的測定檢測能力驗證活動。實驗室嚴格按照GB 5009.259—2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》[7]，對配方乳粉中生物素含量進行檢測。通過對能力驗證的測定過程及結果進行總結分析，為后期檢測工作的開展提供依據和思路。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品NLYZ-YP-058和NLYZ-YP-109（樣品基質為嬰幼兒配方乳粉，鋁箔紙密封袋包裝，河北省食品檢驗研究院）。

1.2 試劑耗材

生物素檢測國標即用型套裝（北京陸橋技術股份有限公司）；硫酸（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；實驗室用水均為無菌水。

1.3 儀器與設備

INE 500型恒溫培養箱（德國Memmert公司）；Cary 60型紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；ME 203型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；PB-21型PH計（德國賽多利斯公司）；HVA-85型高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理

按照GB 5009.259—2016[7]中6.2.2的要求對2份樣品進行相應處理，并進一步稀釋。

1.4.2 培養基和標準溶液制備（無菌操作）

按照生物素檢測國標即用型套裝試劑盒說明書進行培養基、生物素標準溶液和生物素標準工作液的制備。

1.4.3 標準系列管制備

取無菌試管按表1順序加入各成分，制作標準曲線管，1式3份。

表1 標準系列管制作 單位：mL

1.4.4 試樣系列管制備

將制備好的樣品稀釋液使用無菌濾膜（0.22 μm）過濾，按GB 5009.259—2016[7]中6.4.1的要求加入無菌水、無菌樣品溶液和生物素培養基于無菌試管中，混勻。每個梯度做3個平行。

1.4.5 培養

于37 ℃恒溫培養箱中避光培養44～48 h至獲得最大渾濁度。

1.4.6 測定

將培養好的標準系列管、試樣系列管渦旋混勻，使用紫外可見分光光度計于波長550 nm處測定標準系列管、試樣系列管吸光度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

采用Excel以標準系列生物素含量與吸光度進行線性回歸分析，得到線性擬合曲線，如圖1所示。線性回歸方程的相關系數R2=0.990 1，生物素標準曲線線性關系良好。

圖1 生物素標準曲線

2.2 結果計算

按GB 5009.259—2016[7]中6.7.2的要求進行結果計算，具體結果見表2，精密度分別為0.40%和0.73%，結果有效。綜合結果進行上報，樣品NLYZ-YP-058生物素含量為22.4 μg/100 g，樣品NLYZ-YP-109生物素含量為34.1 μg/100 g。結果反饋Z值分別為0.30和0.52，均小于2.0，結果評價均為滿意，表明該項目實驗室檢測能力無偏倚。

表2 樣品測定結果

3 分析與討論

生物素的檢測方法眾多，主要有微生物法、高效液相色譜法、酶聯免疫法、生物傳感器法、熒光免疫層析法等，但每一種檢測方法各具優缺點，各有其適用范圍[8-15]。其中，微生物法測定的生物素是有生物活性的，反映食品中能被人體吸收利用的生物素含量，并且具有靈敏度高、檢測限低、可靠性強、成本較低、適用范圍廣等優點[8]。但該法檢測生物素前處理復雜，操作步驟繁瑣，對試驗器皿和試驗人員操作技術要求較高，且耗時較長，要確保檢測數據準確可從幾方面進行分析，并及時改進[2,16-17]。

3.1 人員

在微生物試驗中，檢測人員的檢測技能、關鍵點掌握、操作熟練度等都對檢測結果準確性有重要影響，因此，檢測人員必須具有夯實的業務能力、熟練的操作技術，實事求是、嚴謹認真的工作態度，能正確理解標準，規范實施檢測[18]。GB 5009.259—2016方法對于很多細節有很高的要求，這就要求檢測人員有一定的檢測經驗積累。因此，在能力驗證時，主檢人員要責任心強、操作經驗豐富、分析和解決問題能力強[19]。

3.2 玻璃器皿處理

在測定過程中，生物素易與抗生素因子結合，污染概率高于泛酸等其他維生素，且油脂會促進植物乳桿菌的生長[17,20]。因此，生物素檢測試驗所有用品要專用，不與其他試驗混合使用，此外，試驗過程中用到的所有玻璃器皿要嚴格處理，使用前用一定濃度鹽酸漂洗，用蒸餾水清洗干凈后170 ℃烘烤3 h，從而去除殘留的微量生長因子。同時，嚴格清理檢測場所，確保無菌潔凈[17,20-21]。

3.3 菌株制備

試驗菌株是維生素試驗的關鍵，因此，必須嚴格控制菌種的保存和轉種，使用前連續傳代3次以增強菌種活力，提高菌種對生物素的敏感性。此外，有研究表明，利用甘油在超低溫條件下凍存處于對數期生長的測試菌種，取出后可直接用于測定中，菌種活性強，測定效果較好，大幅提高實際工作中試驗的效率[22-23]。在能力驗證中所使用的檢測菌株是試劑盒自帶的凍干菌球，取得較好的試驗結果，因此，各實驗室可根據實際需要選擇合適的菌株制備方法。

3.4 試樣制備

試樣前處理是影響測定結果準確性的另一關鍵因素，所以應嚴格按照標準要求進行試樣前處理。GB 5009.259—2016對嬰幼兒配方食品中生物素采用3%（約0.5 mol/L）硫酸進行提取，且隨著硫酸溶液濃度的提高，生物素的含量會下降[24-25]。試樣水解后降溫過程要迅速，避免發生顏色變化。試樣稀釋后的生物素濃度（一般通過樣品標簽標示值獲得）應盡量被標準溶液的系列梯度所覆蓋，必要時可多選幾個稀釋度[21]。同時試樣處理時，需要用氫氧化鈉溶液調節pH，需注意如果調過頭，用H2SO4調回，不能用HCl，因為HCl會使生物素失去活性[20]。

3.5 標準系列管制備

為避免交叉污染，在制備標準系列管時要使用專用的器皿，同時建議按照添加水—培養基—蓋上空白管的試管帽—標液和樣品稀釋液的順序進行操作，標準品、樣品檢測3次[21]。

3.6 培養和測定

所有試管均避光培養直至獲得最大渾濁度，混勻后測定吸光度。國標檢測都采用紫外分光光度計來測定培養物的吸光度，為保證儀器設備工作狀態良好，應按照國家相關法律法規的要求對儀器進行檢定、校準或期間核查，并定期進行維護和性能驗證，做好相關記錄，以減小儀器帶來的誤差并方便溯源，若儀器設備被檢修，恢復使用前應對其進行檢查或校準，以保證性能符合檢測要求。

3.7 結果分析

在標準曲線擬合過程中，各個點并不是嚴格分布在直線上，這是因為微生物生長過程中會受到競爭與抑制作用，隨著生物素濃度的增加，吸光度增長趨緩，所以，通常情況下標準曲線相關系數大于0.95就可以接受[21]。

4 結論

能力驗證采用國標方法對嬰幼兒配方乳粉中的生物素進行測定，取得滿意結果，這離不開實驗室檢測人員仔細閱讀作業指導書、規范操作、對試劑等做好質控等。通過能力驗證，實驗室檢測能力、人員專業技術能力、職業素養等都有了很大提升。

能力驗證不僅可以客觀地衡量實驗室檢測能力和管理水平，也是實驗室內外部質控的有效手段。實驗室通過參加能力驗證活動，可以全面了解實驗室的檢測能力，還可以及時發現存在問題，也為后期開展食品檢驗檢測工作實施提供對照依據和新思路。