保健食品中總黃酮的測定方法操作關鍵點優(yōu)化

劉云龍，譚亞男，陸陽，劉忠瑩，王鑫，金麗鑫

1. 四川省食品檢驗研究院（成都 610097）；2. 國家市場監(jiān)管重點實驗室（白酒監(jiān)管技術）（成都 610097）

黃酮類化合物是自然界中廣泛存在的一類黃色多酚類天然產物，它具有2-苯基色原酮結構使其具有多種生物活性[1-3]，具有抗氧化、抗病毒、抑菌、降血脂、改善血液循環(huán)等多種功效[4-8]，具有較高的藥用價值和保健作用。因此，黃酮類化合物功效指標的檢驗也成為保健食品檢驗工作中的重點。

黃酮類化合物的提取方法有有機溶劑提取法、超聲波提取法、酶解法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[9-15]。保健品生產企業(yè)使用頻度最高的是經乙醇超聲提取，黃酮分子結構中羥基和芳環(huán)形成較強的共軛體系，對紫外光有較強的特征吸收[16]，以蘆丁為對照品，采用分光光度法在360 nm波長處測定，參考《保健食品理化及衛(wèi)生指標檢驗與評價技術指導原則（2020年版）》[17]保健食品中總黃酮的測定中第一法。該方法設備簡單、污染小、適用性廣、提取效率高、準確度和精密度高[18-20]，但使用甲苯作為洗脫溶劑，毒性大，另外方法中有部分操作關鍵點沒有詳細說明。試驗通過考察樣品粉碎粒徑、乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、洗脫溶劑、聚酰胺粉的吸附等因素[21-25]對總黃酮提取率的影響，掌握檢驗操作要點，為保健食品中總黃酮的檢驗檢測工作提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品（20110037，Lot號wkq 20030203，99.99%，四川維克奇生物科技開發(fā)有限公司）；聚酰胺粉（0.150～0.075 mm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙醇、甲苯、甲醇、正己烷（分析純，成都市科隆化學品有限公司），某黃酮類保健品，市售。

1.2 儀器與設備

Evolution201紫外/可見分光光度計（美國Thermo公司）；IDH 30超聲波清洗器（德國IRM公司）；CPA 225 D分析天平（德國Sartious公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準方法[17]

1.3.1.1 標準曲線的配制

準確稱取5.0 mg蘆丁標準品，加甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得質量濃度為50.0 μg/mL的蘆丁標準儲備溶液。

精密吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL蘆丁標準儲備液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成蘆丁質量濃度分別為0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0和25.0 μg/mL的標準系列工作液。

1.3.1.2 樣品處理

稱取一定量的試樣，加乙醇定容至25 mL，搖勻，超聲提取20 min，放置，吸取1.0 mL上清液，于蒸發(fā)皿中，加1 g聚酰胺粉吸附，水浴揮去乙醇，轉入層析柱（層析柱內徑可根據(jù)每個產品具體情況確定）。用20 mL甲苯洗脫，棄去甲苯液；用甲醇洗脫，合并洗脫液并定容至25 mL，即得。

1.3.1.3 測定

取標準系列工作液，于波長360 nm測定吸光度，以蘆丁標準工作液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。取試樣溶液，于波長360 nm測定吸光度，根據(jù)標準曲線得到試樣溶液中總黃酮的濃度，平行測定次數(shù)不少于2次。

1.3.1.4 計算和結果表示（式1）

式中：X為試樣中總黃酮的含量，mg/kg；A為測得的被測液中黃酮質量濃度，μg/mL；M為試樣質量，g；V1為測定吸取試液體積，mL；V2為洗脫后試樣定容體積，mL；V3為提取時試樣定容體積，mL。

1.3.2 單因素試驗考察

分析整個檢驗流程，其中樣品粉碎粒、乙醇體積分數(shù)、超聲提取及靜置時間、聚酰胺粉的吸附能力、洗脫溶劑品種可能是影響總黃酮提取的因素，通過對這些因素的考察，確定操作關鍵點。

1.3.2.1 乙醇體積分數(shù)

標準對于乙醇體積分數(shù)沒有具體說明，按照慣例，一般使用95%乙醇，設計乙醇體積分數(shù)從60%，70%，80%，95%和100%變化，其他因素不變測定某市售保健品總黃酮含量，考察該因素對總黃酮提取的影響。

1.3.2.2 超聲提取過程

考察不同超聲時間和超聲后放置時間對于最終總黃酮提取的影響。以超聲20 min和放置15 min為基準，增加超聲和放置時間。

1.3.2.3 洗脫溶劑

標準中使用甲苯作為洗脫溶劑，毒性較大，試驗考察正己烷和乙醚作為替代，降低試驗操作中的風險。

1.3.2.4 聚酰胺粉的吸附能力

標準規(guī)定使用1 g聚酰胺粉進行吸附，采用不同體積，已知質量濃度0.36 μg/mL的蘆丁溶液考察1 g聚酰胺粉對于總黃酮的吸附上限。吸取1，2，3和5 mL蘆丁溶液于裝有1 g聚酰胺粉的蒸發(fā)皿中，按標準操作測定總黃酮含量。

1.3.2.5 樣品粉碎度

依次將顆粒狀試樣磨碎，分別通過0.125，0.250，0.600和1.00 mm的篩網，不同粗細的樣品和不經粉碎的樣品同法測定，考察樣品粉碎程度對提取的影響。

1.3.2.6 最優(yōu)條件測定及精密度考察

采取優(yōu)化后的操作過程對某市售總黃酮保健品樣品進行測定，將樣品混勻，稱取1 g，超聲20 min后浸提12 h，采用體積分數(shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，洗脫溶劑為正己烷。重復測定樣品6次，計算總黃酮提取量和SRSD。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Microsoft Excel軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析，結果以平均值表示，使用Microsoft Word軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取的影響

如圖1所示，隨著乙醇體積分數(shù)增大，黃酮提取得率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，體積分數(shù)在60%～80%范圍內對總黃酮提取較好，最高點為70%。乙醇體積分數(shù)繼續(xù)提升，總黃酮的提取反而降低。無水乙醇對總黃酮的提取量僅有70%乙醇結果的1/3，這可能和溶劑與總黃酮之間的極性差異相關。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取的影響

2.1.2 超聲和放置提取過程

在放置時間相同的情況下，增加超聲提取時間有助于提升保健品中總黃酮提取率，同樣，相同超聲時間，增加放置時間可以提高總黃酮提取率。如表1和圖2所示，放置時間足夠長，超過12 h時，增加超聲和放置時間都不再提高提取率。放置時間對總黃酮提取的影響大于超聲時間。

表1 不同超聲和放置時間及結果

圖2 不同提取時間組合對總黃酮提取的影響

2.1.3 洗脫溶劑對總黃酮提取的影響

根據(jù)試驗結果，使用正己烷作為洗脫溶劑對總黃酮的提取結果和甲苯結果沒有顯著性差異，乙醚洗脫結果略低，但也在標準允許誤差20%范圍內。可以使用正己烷作為甲苯的替代溶劑。

2.1.4 樣品粉碎度對總黃酮提取的影響

經過0.125，0.250，0.600和1.00 mm的篩網不同粗細的樣品和不經粉碎的樣品測定結果一致，表明經過充分的超聲和提取浸泡時間，保健品粉碎程度對提取結果沒有影響。

2.2 最優(yōu)條件測定結果

采取優(yōu)化后的操作過程對某市售總黃酮保健品樣品進行測定，測定結果從12 mg/kg提高到21 mg/kg，提高約80%，SRSD為3.0%。

2.3 試驗操作其他關鍵點

按照該方法測定保健品中的總黃酮，除單因素考察中的要點外，還需要注意用洗脫溶劑洗脫后，需要用洗耳球排干聚酰胺粉上的洗脫劑，再進行甲醇提取。否則可能存在洗脫溶劑不互溶造成的定容體積差異，導致樣品平行測定結果差異大。

蒸發(fā)皿揮去乙醇這一過程，可用玻璃棒輕輕攪拌按壓結團的聚酰胺粉，確保乙醇完全揮干，總黃酮完全吸附在聚酰胺粉上。揮干乙醇的蒸發(fā)皿需降至室溫后，再進行下一步溶劑洗脫。聚酰胺粉的轉移到層析柱，可通過少量正己烷沖洗蒸發(fā)皿的方式。

3 結論

通過單因素試驗，按照該方法流程，得到保健食品中總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)70%，超聲20 min后浸提12 h，洗脫溶劑為正己烷。在此條件下，可以達到總黃酮提取效率最高，測定結果從12 mg/kg提高到21 mg/kg，提高約80%。該標準方法操作的關鍵點主要在于乙醇體積分數(shù)和超聲提取后的靜置時間。