黃金膠囊對2 型糖尿病大鼠肝臟組織IRE-1、CHOP 表達的影響?

高 攀，余臣祖，康學(xué)東

1 榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林 718000； 2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730101；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730020

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）其并發(fā)癥多且損害嚴重，嚴重增加我國居民醫(yī)療負擔及生活質(zhì)量。目前主流思想認為與胰島細胞功能相關(guān)，然而它的詳盡機理還沒有全部闡明。據(jù)有關(guān)研究顯示，肥胖是糖尿病發(fā)生的前期高危因子，肥胖可以激活機體細胞的炎癥信號通路，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，然而它的深層次發(fā)病機制還未完全解釋明白［1-2］。研究認為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介入T2DM的發(fā)展演變過程，與IR 和β細胞功能減退緊密相關(guān)，參與肥胖、IR 和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，有很大可能是氧化應(yīng)激、炎癥的始動因子，在治療糖尿病方面，是一個急待挖掘新型靶點［3-4］。目前臨床上發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮在改善胰島功能方面療效顯著，但因眾多副作用，嚴重降低患者的依存性，同時單藥使用5 年后有效率下降，需進一步聯(lián)合用藥，中醫(yī)藥的研發(fā)不失為一個很好的銜接點，黃金膠囊是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名中醫(yī)崔慶榮主任醫(yī)師在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上結(jié)合濁毒理論，從南宋陳無擇《三因極一病證方論》溫膽湯加減化裁而來，全方具有清熱解毒、運脾化濁之效，前期研究顯示，其能降低血糖、改善胰島素抵抗［5-6］。本實驗通過觀察肝樣本ERS 標志性分子肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1）、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）的表達情況，深挖黃金膠囊治療T2DM的潛在機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性Wistar 大鼠，平均體質(zhì)量（200±20）g，2～3 月齡，共60 只。取材于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物繁殖區(qū)，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度20～25 ℃，空氣相對濕度40%～70%，飼養(yǎng)許可證號：SYXK（甘）2015-0005。動物實驗符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理要求

1.2 實驗藥物黃金膠囊（黃連、雞內(nèi)金、法半夏、竹茹、枳實、陳皮、茯苓、炙甘草）（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科提供，批號：171103，規(guī)格：0.45 g/粒）；羅格列酮（重慶涪陵制藥廠，國藥準字H20041399，規(guī)格：4 mg/片）；0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：N18040807-1，規(guī)格：0.9 g：250 mL/瓶）。

1.3 試劑與儀器鏈脲佐菌素（北京索萊寶科技有限公司，批號：641J033）；IRE-1（上海鈺博生物科技有限公司，批號：YB-16696R）；CHOP（上海鈺博生物科技有限公司，批號：YM3668）；高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）（南京建成生物工程研究所，批號：A112-1）；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（南京建成生物工程研究所，批號：A113-1）；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）（南京建成生物工程研究所，批號：A111-1）；甘油三酯（triglyceride，TG）（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1-1）；引物設(shè)計合成（上海生工公司）。DZF-OB 型臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；02211601B 型血糖儀（美國強生器材有限公司）；DW-HL528 型超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；LDZX-50KBS 型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DYY-6D 型Western blot 轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司），iMark 型酶標儀（BIO-RAD 公司）；SK-O180-E 型搖床（德國IKA公司）；DYY-6D 型Western blot 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；BC/BD-208HNE 型恒溫培養(yǎng)箱（澳柯瑪股份有限公司）；TGL-16 型高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf 公司）；MX-S 型渦旋振蕩器（美國賽洛捷克）；D1008E 型小型離心機（美國賽洛捷克）；NanoDrop One型NanoDrop核酸濃度測量儀（美國Thermo）；Applied Biosystems Step One PlusTM型實時定量PCR儀（美國Agilent）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 首先給予大鼠普通飼料適應(yīng)環(huán)境1周，然后禁食12 h，抽取尾靜脈測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。血糖位于4.77～7.77 mmol/L 范圍內(nèi)的樣本作為研究選材［7］。將入選的56只樣本鼠按體質(zhì)量編號并用數(shù)字表隨機分為正常組（8 只）與造模組（48 只），造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周，觀察大鼠體質(zhì)量變化，體質(zhì)量增加10%為達標，其中1只大鼠體質(zhì)量不達標剔除［8］。給予造模組大鼠在后空腹12 h后，每只分別單次按35 mg/kg的量腹腔注射STZ，3天后測定大鼠血糖滿足FPG≥11.0 mmol/L或PPG≥16.7 mmol/L并在兩周后血糖仍舊維持達標狀態(tài)大鼠作為模型實驗鼠。隨機將血糖達到制模標準的模型鼠40只分成羅格列酮組、模型組以及黃金膠囊高、中、低組5個組。

1.4.2 給藥方法 按人與大鼠體表面積折算法及前期實驗研究［6］制定相應(yīng)的藥物劑量，黃金膠囊給藥劑量：高劑量組2.025 g/kg、中劑量組1.265 g/kg、低劑量組0.675 g/kg，羅格列酮組0.5 mg/kg，空白組、模型組給予等劑量的生理鹽水。各組大鼠每日灌胃1次，共治療10周。

1.5 指標檢測1.5.1 FBG及血脂四項 灌胃結(jié)束后，隔夜禁食、水12 h，采血測FBG；采血后離心機離心，用ELISA 法測試血脂四項（TC、TG、HDL-C、LDL-C）。

1.5.2 RT-PCR檢測IRE-1、CHOP的mRNA表達 取肝臟組織，放置于提前編號的凍存管中，置于-80℃冰箱。采用Trizol 法從大鼠肝組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用兩步法PCR反應(yīng)程序，Step1：95 ℃ 120 s，1Cycles，Step2：95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，40Cycles，以β-actin為內(nèi)參，用2-△△ct計算mRNA的相對表達量。見表1。

表1 基因引物序列

1.5.3 肝組織病理觀察 肝臟樣本4%甲醛固定，石蠟包埋，制成冠狀切片，蘇木素-伊紅液染色，觀測肝樣本組織鏡下病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4 Western blot 檢測IRE-1、CHOP 的蛋白表達 取200 mg 冰凍的肝樣本組織提取其內(nèi)蛋白，BCA法測定含量，變性蛋白樣本，通過SDS-PAGE電泳分離，進行印跡轉(zhuǎn)膜，然后利用抗體免疫雜交，在暗室曝光顯影，使用Quantity One 軟件對條帶光密度定量分析，通過各研究蛋白和對應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值比，評估研究蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法全部原始資料導(dǎo)入SPSS 20.0軟件中分析，計量資料以±s表示，通過單因素（one-way ANOVA）方差分析多組間比較，繼以LSD進行多重比較，對于方差不齊的數(shù)據(jù)使用Games-Howell方法分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠FBG水平與模型組比較，羅格列酮組及黃金膠囊組血FBG 均有所下降（P＜0.05）；與常規(guī)羅格列酮組比較，黃金膠囊中、低劑量組療效欠佳（P＜0.05），但高劑量組與之效果接近（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠治療后FBG及血脂指標比較（±s） mmol/L

表2 各組大鼠治療后FBG及血脂指標比較（±s） mmol/L

注：與空白組比較，1）表示P＜0.05；與模型組比較，2）表示P＜0.05；與羅格列酮組比較，3）表示P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊低劑量組黃金膠囊中劑量組黃金膠囊高劑量組HDL-C 8.68±2.01 2.33±1.781）8.14±2.612）1.79±0.732）3）3.62±1.702）3）6.85±1.972）鼠數(shù)8 8 8 8 8 8 FBG 4.725±0.982 17.888±1.8711）8.113±0.7181）2）14.500±2.0451）2）3）9.763±0.9271）2）3）7.775±0.5311）2）TG 0.45±0.40 2.23±0.611）0.51±0.252）2.23±0.442）3）0.93±0.472）3）0.54±0.342）T-CHO 2.40±0.94 4.99±2.281）2.62±0.662）4.05±1.102）3）3.43±0.952）3）2.63±1.382）LDL-C 1.09±0.60 5.15±1.731）1.11±0.572）4.62±1.862）3）2.66±0.802）3）1.25±0.602）

2.2 血脂水平與模型組比較，羅格列酮組及黃金膠囊組血脂水平均有所下降（P＜0.05）；與常規(guī)羅格列酮西藥組比較，黃金中藥組中、低劑量組療效欠佳（P＜0.05），但高劑量組與之功效接近（P＞0.05）。見表2。

2.3 大鼠肝臟病理形態(tài)空白組HE 切片均勻染色，可見清晰的肝葉結(jié)構(gòu)，規(guī)則的肝索排列，清晰的細胞核結(jié)構(gòu)，無顯著的脂肪變性、壞死，界板無炎癥或纖維化。模型組與空白組比較，肝小葉結(jié)構(gòu)失去正常形態(tài)，肝索紊亂地排列，整體背景染色變淡，肝細胞的體積增大，脂肪沉積呈氣球樣變性，周圍有許多炎性細胞浸潤。與模型組相比，羅格列酮組整體肝小葉結(jié)構(gòu)較為清晰，與正常形態(tài)接近，肝細胞排列也相對整齊，其周圍偶爾可見穿插少量的炎性細胞，同時肝細胞的氣球樣脂肪變性也相對減少。與模型組相比，隨著藥物濃度的增高，黃金膠囊組樣本切片鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)由模糊變得清晰，肝索排列由紊亂變得規(guī)則，而肝細胞脂肪氣球樣變性隨之減輕，其周圍的炎性細胞浸潤也明顯減少，見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)（HE，×40）

2.4 大鼠肝臟組織lRE-1、CHOP mRNA 及蛋白表達與空白組比較，模型組肝樣本中IRE-1、CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均增加（P＜0.05）；與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊組IRE-1 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均降低（P＜0.05）；與模型組比較，羅格列酮及黃金膠囊高、中劑量組CHOP mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達均降低（P＜0.05）；與羅格列酮組比較，黃金膠囊中、低劑量組療效欠佳（P＜0.05），但高劑量組與之效果接近（P＞0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織IRE-1、CHOP蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠肝臟組織lRE-1、CHOP mRNA及蛋白水平比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟組織lRE-1、CHOP mRNA及蛋白水平比較（±s）

注：1）表示與空白組比較P＜0.01；2）表示與模型組比較P＜0.05；3）表示與羅格列酮組比較P＜0.05

組別空白組模型組羅格列酮組黃金膠囊低劑量組黃金膠囊中劑量組黃金膠囊高劑量組CHOP 1.480±0.065 2.663±0.1921）1.543±0.0212）2.202±0.0892）3）1.990±0.0832）3）1.696±0.0962）鼠數(shù)8 8 8 8 88 IRE-1 mRNA 1.002±0.085 2.803±0.1141）1.265±0.0202）2.258±0.030）2）3）1.775±0.0272）3）1.146±0.0332）CHOP mRNA 1.002±0.074 2.586±0.0191）1.368±0.0162）2.153±0.0012）3）1.730±0.0262）3）1.168±0.0182）IRE-1 0.763±0.039 1.465±0.1281）0.855±0.0572）1.261±0.0472）3）1.118±0.0382）3）0.825±0.0372）

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是人體細胞的“加工車間”，是細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)臉屑~站，參與蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運。機體長期處于糖毒、脂毒環(huán)境中，會促使胰島素的分泌增多，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成折疊蛋白的負荷，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇蛋白1（inositol-requiring enzyme1，IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6 等信號通路向細胞核傳遞信息，細胞通過反饋減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白的來源，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中酶折疊蛋白的能力和降解蛋白的能力，從而進行自我保護，一旦上述代償機制崩潰，則啟動凋細胞亡機制［9-11］。對于ERS 反應(yīng)由自我保護到啟動凋亡程序的具體機制尚不清楚，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷程度、IRE1α 構(gòu)象變化等因素相關(guān)［12］。GHOSH等［13］使用變構(gòu)抑制劑抑制IRE1α 的RNA 酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島β細胞的活力與功能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中得到保護。在另一個研究中，研究者給予Bi-1（Bax 抑制劑-1，是IRE1α 的負性調(diào)控因子）基因敲除小鼠ERS 誘導(dǎo)劑后顯示IRE1α 依賴性肝細胞死亡途徑增強，在該研究的子實驗中發(fā)現(xiàn)Bi-1 基因敲除小鼠表達IRE1α、XBP1 和CHOP 增多，激活細胞死亡途徑，導(dǎo)致非酒精性脂肪肝［14］。胰島素抵抗常可使脂肪在肝臟沉積發(fā)生脂肪變、增加肝糖原分解輸出，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，常在肥胖小鼠肝臟和脂肪組織病理切片中發(fā)現(xiàn)［15］。根據(jù)血糖結(jié)果提示模型制作成功，在大鼠血脂水平升高的同時病理HE 染色模型組大鼠肝臟細胞出現(xiàn)明顯的脂肪沉積、氣球樣變性、體積增大并伴有大量的炎性細胞浸潤。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的分子標志IRE-1、CHOP蛋白與mRNA表達水平也明顯升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂對肝細胞功能造成了一定影響進而導(dǎo)致肝臟病理損害。與模型組比較，黃金膠囊不同劑量組IRE-1、CHOP 蛋白及mRNA 表達量明顯降低，血脂水平下降，肝臟病理損害明顯改善，提示黃金膠囊可以通過降低IRE-1、CHOP 表達起到保護肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。

中醫(yī)學(xué)認為，人體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝正常途徑，首先由胃腐熟水谷中的精微，由脾運化傳遞，上達至肺，聯(lián)合自然清輕之氣形成宗氣，在心化赤為血，配合肝的疏泄，營養(yǎng)四肢百骸。目前空氣污染嚴重，人們飲食不節(jié)制，飲食不潔，精神壓力增加，勞傷增加。外環(huán)境、飲食習(xí)慣不良濁毒之邪皆會損害運化水谷精微的肺脾，脾氣不升則痰濕生化有源，肺氣不降則濁陰歸途無路。精神壓力大使肝氣不得疏泄，疏泄功能下降影響血液的運行導(dǎo)致血瘀，橫逆克土，進一步阻礙脾胃的運化，使痰、濕進一步增加。勞傷使各臟腑功能失調(diào)，影響營養(yǎng)物質(zhì)的輸布。由此導(dǎo)致人體各臟腑功能紊亂，精微物質(zhì)瘀積，形成痰飲、瘀血等病理產(chǎn)物，變生濁邪，久郁化熱，成為濁毒。濁毒可流注于四肢關(guān)節(jié)、臟腑百骸而發(fā)揮其相應(yīng)的致病作用，究其病機，多為肺、肝、脾臟腑功能失調(diào)，濁毒內(nèi)蘊。從微觀角度看，糖毒、脂毒等多種因素作用于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而產(chǎn)生氧化應(yīng)激、細胞凋亡造成病理損害，似乎與之相投。因此增強臟腑功能，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理錯誤折疊蛋白的能力，減除濁毒刺激，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的刺激源，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的損害因子，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保護性應(yīng)激反應(yīng)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促凋亡機制的發(fā)生，可作為藥物研究的切入點。

黃金膠囊用藥根據(jù)糖尿病濁毒理論機制，方中黃連味苦性寒，清煩躁郁熱之火，燥脾、胃、膽、大腸之濕，清解郁毒、滋陰止渴；雞內(nèi)金其性平和，通達脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)，可健補脾胃，消除臟腑之瘀積，有縮小便之功。二者共為君藥，使脾胃瀉中有補，使痰濁燥消并用，釜底抽薪，使?jié)崛ザ緹o所依，標本兼治，化濁解毒，具有治療脾癉、消渴的作用。法半夏味苦性燥，降脾胃之濁氣，祛濕濁之壅滯；竹茹秉微涼之體，清肺胃之郁熱，降肺、胃、膽氣于下，引濕濁下行；枳實破氣下行，滌濕濁之凝滯；陳皮辛散導(dǎo)滯，苦燥消痰，暢達脾土之氣；茯苓甘補健脾以升清。以上五藥為臣藥，使脾胃后天之氣升降相宜，濕濁無藏匿之所。炙甘草味甘氣溫，順達諸性，配潤劑含育陰之功，協(xié)和諸藥，使之不爭，為使藥。本方補瀉并用，寒熱同調(diào)，共奏運脾化濁，清解郁毒之功。

綜上所述，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2 型糖尿病模型大鼠肝臟組織中存在IRE-1、CHOP 基因表達的異常，黃金膠囊通過降低IRE-1、CHOP 表達而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而發(fā)揮其治療2型糖尿病的作用。