獨活寄生湯對膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠NF-κB 通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響?

張 銳，馬繼海，柴喜平，李愛強，柳海平

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是軟骨退行性改變的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜、軟骨、軟骨下骨及關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶等結(jié)構(gòu)損傷為主要病理變化［1］。KOA 多見于中老年人及運動員等人群，65 歲以上人群發(fā)病率高達(dá)60%，而肥胖患者更易出現(xiàn)，該病常遷延不愈，在疾病后期會發(fā)生步行障礙、關(guān)節(jié)畸形等［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床用藥雖能延緩疾病進(jìn)展，但并無特效療法阻止該病發(fā)生發(fā)展［3］。近年來中醫(yī)藥防治KOA療效確切，且具有優(yōu)勢［4］。因此，本研究基于中醫(yī)“滋補肝腎”理論，結(jié)合核因子核因子κB（nuclear factorkappaB，NF-κB）通路的分子生物學(xué)理論背景，建立白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）介導(dǎo)NF-κB信號通路在肝腎虧虛KOA 軟骨微環(huán)境中的級聯(lián)響應(yīng)及獨活寄生湯干預(yù)效應(yīng)的可能機制”工作假說，為臨床應(yīng)用獨活寄生湯治療KOA 提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇健康SPF 級Wistar 大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（160±20）g，均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物設(shè)施使用證明：00000230，實驗動物合格證號：62001000001412。飼養(yǎng)條件：適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天，自由進(jìn)食水，采用每12 h 明暗交替進(jìn)行，濕度控制在40%～70%之間，溫度控制在20～25 ℃，日溫差≤4 ℃，氨濃度＜l5 mg/m3，噪音≤60 dB。動物實驗遵守實驗動物福利倫理審查指南。

1.2 藥物及試劑獨活寄生湯藥物組成：獨活9 g，桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防風(fēng)、川芎、人參、甘草、當(dāng)歸、芍藥、干地黃各6 g。由甘肅省中醫(yī)院制劑室加工，常法煎煮后濾出藥液加熱濃縮至每1 mL 藥液含生藥1 g，使用時稀釋至所需濃度。將硫酸氨基葡萄糖制成0.3 g/kg 備用試藥，均置于4 ℃冰箱以備灌胃使用。IL-4 Elisa 試劑盒（批號：1803K7110）、IL-6 Elisa 試劑盒（批號：1803K1527）、IL-10 Elisa試劑盒（批號：1803K4365）、TNF-α Elisa 試劑盒（批號：1803K2573）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：20181343）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號：20181363）、抗NF-κB p65 及p-NF-κB p65（批號：20181407）多克隆抗體均由北京索萊寶有限公司生產(chǎn)；GAPDH（批號：ZS-257693）、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記（批號：152231）均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；ECL 顯色試劑（美國 Millipore 公司，批號：19174233）。

1.3 實驗儀器9U-ND25-2 型OLYMPUS 熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）、MA-6000 型基因擴增儀（蘇州雅睿生物有限公司）；DNM-9602 型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；PowerPoc Basic凝膠電泳儀（美國Bio-rad 公司）、Chemi-DocTMXRS+凝膠成像分析儀（美國Bio-rad公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 將60 只SPF 級Wistar 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后分為空白組（10 只）和造模組（50 只）。造模組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后，氯胺酮按照0.1 g/kg 的劑量腹腔注射，麻醉顯效后，使用1 mL 注射器向大鼠右膝關(guān)節(jié)腔注射4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液，注射量0.25 mL/kg，每隔7天注射1次，連續(xù)注射3次造模成功。造模成功表現(xiàn)：造模組大鼠關(guān)節(jié)處皮膚顏色發(fā)紅、明顯腫脹，行走或活動時造模肢體屈伸困難，常有保護(hù)性反射；病理觀察見軟骨細(xì)胞增生，滑膜細(xì)胞增多，細(xì)胞大量聚集、排列紊亂。模型制備成功后按隨機數(shù)字表法分為模型組，硫酸氨基葡萄糖組（陽性組），獨活寄生湯高、中、低劑量組，共5組，每組10只。

1.4.2 給藥方法 獨活寄生湯組及陽性組給藥劑量均按70 kg 成人和大鼠體表面積折算的等效劑量，各藥物干預(yù)組分別給予制備的藥物水溶液等體積灌胃，空白組及模型組大鼠給予等體積灌胃生理鹽水，每次2 mL，每日1 次，連續(xù)灌胃21天，第21天進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況 觀察各組大鼠一般生存狀況主要包括大鼠活躍性，毛發(fā)光澤飲食等情況。

1.5.2 大鼠軟骨組織病理變化 采用蘇木精-伊紅染色法（HE）法觀察各組大鼠軟骨組織病理變化。

1.5.3 炎癥因子水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測軟骨組織及血清IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α水平。

1.5.4 炎癥因子mRNA 表達(dá)水平 采用熒光定量PCR 法檢測各組大鼠軟骨組織中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及NF-κB p65 的mRNA表達(dá)水平。

1.5.5 NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組軟骨組織NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，采用Bonferroni法；方差不齊，采用Tamhane′s T2法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般生存狀況空白組大鼠活躍，毛發(fā)整齊光澤，飲食飲水正常，活躍易動；與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)凌亂，飲食飲水較少；與模型組比較，獨活寄生湯各劑量組精神狀態(tài)較好，毛發(fā)飲食等恢復(fù)正常；獨活寄生湯高劑量和陽性組效果較好接近空白組，低劑量組和模型組比較一般生存狀況無明顯差異。

2.2 大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平與空白組比較，模型組IL-4、IL-6及TNF-α水平均升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，獨活寄生湯各劑量組、陽性組IL-4、IL-6 及TNF-α 水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，獨活寄生湯高劑量組、陽性組IL-10水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平比較（±s） pg/mL

表1 各組大鼠血清lL-4、lL-6、lL-10及TNF-α水平比較（±s） pg/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與空白組比較，P＜0.01

組別空白組模型組陽性組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組TNF-α 4.65±0.96 13.84±3.57#5.02±0.88*10.51±2.69*8.79±1.56*5.17±1.09*鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 IL-4 2.08±0.05 14.42±3.68#4.61±0.77*10.29±2.54*6.93±1.89*5.22±0.91*IL-6 6.76±1.53 13.96±3.27#7.44±1.61*12.85±2.67*10.29±1.84*8.56±1.93*IL-10 10.23±2.37 3.55±0.86#8.19±1.74*4.68±1.17 5.16±1.44 7.84±1.56*

2.3 大鼠軟骨組織lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α 及NF-κB p65 的mRNA 表達(dá)水平與空白組比較，模型組IL-4、IL-6、TNF-α 及NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05），IL-10 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，獨活寄生湯中、高劑量組，陽性組IL-4、IL-6、TNF-α 及NF-κB p65 水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，獨活寄生湯中、高劑量組，陽性組IL-10水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α、NF-κB p65 mRNA及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠lL-4、lL-6、lL-10、TNF-α、NF-κB p65 mRNA及NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與空白組比較，P＜0.01

組別空白組模型組陽性組獨活寄生湯低劑量組獨活寄生湯中劑量組獨活寄生湯高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 IL-4 mRNA 5.36±0.77 10.79±1.62#6.24±0.81*9.87±1.34 IL-6 mRNA 5.07±0.65 12.34±2.02#6.59±0.93*9.69±1.70 IL-10 mRNA 5.97±0.61 1.26±0.05#4.33±0.46*1.79±0.06 TNF-αmRNA 5.21±0.79 14.07±3.11#7.87±1.04*12.53±2.86 NF-κB p65 mRNA 5.44±0.65 11.06±1.43#6.15±0.87*10.58±1.02 NF-κB p65蛋白1.83±0.18 4.87±0.25#2.25±0.21*3.77±0.31**p-NF-κB p65蛋白0.76±0.08 2.64±0.22##1.17±0.14**2.04±0.17**10 8.15±0.96*7.83±0.92*2.53±0.11*9.04±1.38*8.97±0.72*3.02±0.29*1.56±0.12**1.21±0.13**10 7.22±0.75*7.04±0.87*3.45±0.17*8.16±1.27*7.31±0.68*2.97±0.28*

2.4 大鼠軟骨組織NF-κB p65及p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)與空白組比較，模型組NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，獨活寄生湯各劑量組、陽性組NF-κB p65及p-NF-κB p65水平均降低（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)電泳圖

2.5 大鼠軟骨組織HE 染色結(jié)果空白組大鼠軟骨組織各層細(xì)胞排列均勻、整齊，結(jié)構(gòu)清晰完整，表面光滑，軟骨基質(zhì)著色均勻，潮線完整；模型組大鼠軟骨組織細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，表面粗糙，基質(zhì)著色不均勻；與模型組比較，陽性組和獨活寄生湯各劑量組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)較完整、清晰，表面較光滑，軟骨基質(zhì)著色較均勻。見圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織病理圖（HE，×100）

3 討論

中醫(yī)將膝骨關(guān)節(jié)炎歸屬于“骨痹”“膝痛”“痹證”等范疇。《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》曰：“肝生筋”，認(rèn)為若肝血不足，則筋失濡養(yǎng)，動則易疲，拘急不利，可致肢體關(guān)節(jié)僵硬、屈伸不利等［5］。《類學(xué)·卷十八》曰：“筋雖主于肝，而維絡(luò)關(guān)節(jié)以立保身者，唯膝之筋為最，故膝為筋之府。”認(rèn)為筋的濡養(yǎng)與肝密不可分，當(dāng)肝臟疏泄正常，方能氣血對調(diào)，輸布血液到經(jīng)筋，維持筋的正常生理活動，指出KOA 的發(fā)生病在關(guān)節(jié)，與筋密切相關(guān)［6］。《素問·六節(jié)藏象論篇》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之均也。”腎臟為藏精之所，腎精足則腎氣充，方可推動和調(diào)控機體精氣血津液的新陳代謝及能量的相互轉(zhuǎn)化，腎氣充，腎精足，則骨髓化生有源，骨骼健壯，筋骨堅利，關(guān)節(jié)不易退變，活動自如，若腎精不足，則骨骼失養(yǎng)，可致骨軟無力、骨質(zhì)脆弱、折損，屈伸不利等［7］。可見，腎在KOA的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，故該病主要病機責(zé)之于肝腎之虛，治療則以祛風(fēng)勝濕、滋補肝腎為法，常用獨活寄生湯加減治療。

獨活寄生湯出自《備急千金要方》，具有滋補肝腎，祛風(fēng)止痛之功。方中重用獨活為君，辛苦微溫，善治伏風(fēng)，除久痹，且性善下行，可祛下焦與筋骨間的風(fēng)寒濕邪。臣以細(xì)辛、防風(fēng)、秦艽、桂心，細(xì)辛長于搜陰經(jīng)之風(fēng)寒濕邪，又除經(jīng)絡(luò)留濕；秦艽祛風(fēng)濕，舒筋絡(luò)而利關(guān)節(jié)；桂心溫經(jīng)散寒，通利血脈；防風(fēng)祛一身之風(fēng)而勝濕，君臣相伍，共祛風(fēng)寒濕邪。佐以桑寄生、杜仲、牛膝以補益肝腎而強壯筋骨，且桑寄生兼祛風(fēng)濕，牛膝尚能活血以通利肢節(jié)筋脈；當(dāng)歸、川芎、地黃、芍藥養(yǎng)血和血，人參、茯苓、甘草健脾益氣。以上諸藥合用，具有補肝腎、益氣血之功。研究表明，運用獨活寄生湯治療KOA 療效顯著［8-9］，但獨活寄生湯是通過何種方式抑制膝骨關(guān)節(jié)病變的機制尚不明確，因此積極開展獨活寄生湯防治KOA 相關(guān)研究，具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體長期處于非可控性炎癥狀態(tài)時，可發(fā)生炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，其機制與NF-κB 信號通路活化關(guān)系密切［10］，而KOA 作為具有慢性炎性反應(yīng)特征的疾病，與NF-κB 信號通路活化及其下游分子的表達(dá)密切相關(guān)［11］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6 等因子不僅導(dǎo)致了持久的炎癥過程，同時參與了骨和軟骨破壞過程以及疼痛的傳輸［12］。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生湯組、陽性組中血清和軟骨組織中的IL-4、IL-6、TNF-α 的表達(dá)明顯降低，IL-10 表達(dá)升高，說明獨活寄生湯抑制了炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而影響炎性細(xì)胞浸潤至損傷的局部組織，這可能是獨活寄生湯治療KOA 的機制之一；NF-κB 作為炎癥反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，其不僅存在于KOA 患者的軟骨組織中，同時在滑膜組織、關(guān)節(jié)液及周圍肌肉中均有表達(dá)，正常生理狀態(tài)下，胞內(nèi)NF-κB 二聚體，包括p65 被IκB 隔離在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)NF-κB 信號通路被上游因子激活時，IκB 被磷酸化后NF-κB 蛋白被釋放，從而向細(xì)胞核內(nèi)遷移來促進(jìn)或抑制特定因子的表達(dá)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生湯高劑量組和陽性組軟骨組織中的NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平均明顯降低。國內(nèi)學(xué)者陳鵬等［15］通過制備兔KOA 模型證實KOA 炎癥可能與其上調(diào)滑膜組織中滑膜細(xì)胞LXRs/NF-κB通路、下調(diào)P65蛋白，進(jìn)而抑制下游TNF-α、IL-1β等因子的表達(dá)有關(guān)。另有學(xué)者建立SD 大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，使用消腫止痛顆粒干預(yù)8 周后，與模型對照組比較，消腫止痛顆粒組關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB mRNA 表達(dá)明顯降低，這些研究與本研究的結(jié)果相一致，說明獨活寄生湯抑制KOA 的發(fā)展與NF-κB p65 及p-NF-κB p65 因子密切相關(guān)，是其作用機制之一。

綜上所述，獨活寄生湯可能通過抑制IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB p65 及p-NF-κB p65 表達(dá)，促進(jìn)IL-10 升高來減輕關(guān)節(jié)軟骨的退變，從而延緩KOA病情的進(jìn)展。