間充質干細胞治療終末期肝病的臨床研究進展

馮 宇, 陳俊峰, 林炳亮

中山大學附屬第三醫院感染性疾病科, 廣州 510630

肝臟具有消化、解毒、內分泌等多種功能,并且有強大的自我再生能力。終末期肝病(end-stage liver diseases, ESLD)是指各種損傷引起的肝臟結構和功能不可逆改變已經到了晚期階段,包括各種類型的肝衰竭、失代償期肝硬化,預后通常很差。肝移植是治愈此階段患者唯一的方法,但肝源短缺、移植后免疫排斥、費用昂貴等問題極大限制了其在臨床上的應用。近年來興起的細胞療法得到了廣泛關注,其中的干細胞療法更被認為是有極大前景的肝移植替代療法[1]。

1 間充質干細胞(MSC)是肝病治療領域應用最廣的干細胞

干細胞是一組具有多向分化潛能的細胞群,在體外適宜條件下可以被誘導分化為肝細胞樣細胞(hepatocyte-like cells, HLC),具有完整的肝細胞功能。此外,它還可以旁分泌很多細胞因子,改變受損肝臟的局部微環境,調節免疫功能減輕肝臟炎癥損傷,刺激肝細胞再生。臨床上常用的干細胞包括:MSC、胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)和造血干細胞(hematopoietic stem cell, HSC)等。ESC受限于免疫排斥問題,而HSC體外增殖能力有限,故應用MSC治療肝病的研究最為廣泛。

MSC主要集中在人的骨髓和臍帶血,從來源上可將MSC分為骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)、臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC)、脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AMSC)等。因其不表達MHCⅡ類抗原,很少表達MHCⅠ類抗原,故免疫原性很低,MSC移植具有較高的安全性。BM-MSC遷移能力最強,旁分泌功能強大[2],是當下研究的熱點。其分泌的外泌體(Exo)是一種細胞外囊泡,攜帶了多種生物活性物質,包括蛋白質、miRNA和DNA等[3]。它可以代替“母細胞”通過調節不同靶細胞的信號通路發揮作用,是很有前景的“無細胞”治療方案。

2 干細胞治療肝病的機制

2.1 干細胞可以分化為HLC發揮功能并向受損肝臟歸巢 20世紀初,Yan等[4]通過體外培養從肝硬化失代償期患者外周血中分離BM-MSC,發現重組人肝細胞生長因子可以誘導干細胞轉分化為HLC。進一步在動物實驗中借助示蹤蛋白發現移植的BM-MSC首先向肺部累積,之后才向損傷的肝臟歸巢[5]。Yu等[6]將人的UC-MSC移植入肝臟受損的小鼠體內,小鼠肝臟HE染色顯示壞死肝臟面積縮小,且人白蛋白、細胞角蛋白-18染色呈陽性,說明人UC-MSC可以歸巢到受損組織并分化為有功能的肝細胞。但到目前為止,MSC歸巢的機制還未完全闡明,干細胞分化程度不足、效率低下的問題仍需更多實驗來探索解決。

2.2 干細胞通過旁分泌機制調節免疫、抑制纖維化修復受損肝臟 隨著研究的深入,人們認識到MSC通過旁分泌機制改變肝臟局部微環境比向HLC轉分化對于肝臟的修復更重要[7],這種機制主要通過MSC旁分泌細胞因子的方式調節機體的免疫,進而改善肝臟的纖維化,這些細胞因子包括吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、轉化生長因子β(transforming growth factor-beta, TGF-β)等[8]。對固有免疫來說,MSC可以誘導巨噬細胞向M2亞型極化,分泌IL-10并清除壞死的肝細胞,緩解肝臟炎癥損傷[9]。NK細胞的功能也不同程度受到MSC影響,表現為功能激活或功能抑制。對適應性免疫來說,T淋巴細胞和B淋巴細胞功能均被抑制。已有研究[10]表明,MSC釋放的TGF-β可以抑制ERK1/2的磷酸化,影響細胞周期蛋白使之停止在G1期,進而減少T淋巴細胞的增殖。還有臨床研究結果[11]表明T淋巴細胞的分化亦受MSC影響,自體BM-MSC移植治療HBV相關性肝硬化患者的外周血中Th17細胞向肝臟流入減少,調節性T淋巴細胞(regulatory T cell, Treg)數量增加。與MSC共培養的B淋巴細胞的增殖能力和分泌抗體能力也出現大幅下降,其表面CXCR4等趨化因子受體表達減少[12]。

MSC可以通過下調TGF-β1受體和平滑肌α肌動蛋白(smooth muscle α-actin, α-SMA)等的表達間接減輕肝臟纖維化[13]。MSC分泌乳脂小球-EGF因子8(milk fat globule-EGF factor 8, MFGE8)減少星狀細胞表面的TGF-β1受體表達,還可以通過激活Notch通路下調星狀細胞的α-SMA表達,從而抑制星狀細胞的活化[14]。除Treg和Th17細胞比例失調外,IL-17水平也有顯著下降,兩者共同抑制了星狀細胞活化并促進其凋亡,進而影響了Ⅰ型膠原的沉積及胞外基質的合成[15],相關動物實驗結果表明這可能和TGF-β/Smad通路、NADPH氧化酶通路被抑制有關[16]。此外,MSC還可以分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-9、MMP-14等直接降解胞外基質[17]。直接和間接兩種途徑協同減輕了肝臟纖維化的程度。

2.3 Exo通過多種機制減少肝臟損傷并助其再生

Exo是一種攜帶多種生物活性物質的細胞外囊泡,從MSC分泌的Exo由于其無細胞特性日益受到重視。和細胞相比,Exo體積更小,結構更簡單,更容易合成和保存,形成腫瘤的風險也更小。更重要的是,因其膜蛋白數量更少故免疫原性也遠低于MSC,能避免干細胞直接移植帶來的很多問題。研究[18]發現,MSC-Exo能減輕肝移植中肝的缺血再灌注程度,這可能和Exo激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-1-磷酸通路有關。在刀豆球蛋白-A(concanavalin A, Con-A)誘導的肝損傷小鼠模型[19]中發現,Exo可以遷移到肝臟,增加肝組織增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達,使肝細胞從G0期進入G1期。Zhao等[20]發現Exo通過自噬途徑減少肝細胞的凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2表達增多,促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達減少。Lin等[21]發現Exo中let-7a-5p通過MAP4K3通路增加轉錄因子EB (transcription factor EB, TFEB)的核轉位來增強肝臟自噬活動,最終緩解慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure, ACLF)患者的肝損傷。

Exo還可以通過抑制NLRP3炎癥小體通路減輕肝細胞炎性損傷。有研究[22]發現增加Exo中miR-223的表達強度明顯降低了小鼠肝組織中NLRP3的表達;急性肝損傷動物模型中也發現MSC的Exo可以阻斷IL-6介導的信號通路[23]和下調NLRP3通路[24]。此外,它還可以降低血管內皮黏附分子1的表達下調免疫強度發揮抗炎作用[25]。Exo同樣可以下調CCl4誘導肝纖維化大鼠的肝星狀細胞中Wnt/β-catenin通路的信號強度[26],降低星狀細胞的活化程度,以此減輕肝纖維化。

3 干細胞治療ESLD的臨床研究

在治療肝病方面最常用的干細胞是MSC,其次是預先用粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)動員后獲得的骨髓源性干細胞(bone marrow derived stem cell, BMSC),前者以BM-MSC和UC-MSC多見,供體干細胞來源多為自體或同種異體。

3.1 干細胞治療肝衰竭 自體MSC移植對治療ACLF患者是安全的,在短期內可以改善肝衰竭患者的肝功能。Salama等[27]對HCV相關肝衰竭患者的BM-MSC進行G-CSF動員后由外周靜脈自體輸注,隨訪26周后發現,移植組54%的患者轉氨酶、白蛋白、膽紅素等水平得到改善。該團隊[28]還應用自體BM-MSC經肝動脈或門靜脈移植入48例肝衰竭患者,半年后患者的凝血功能國際標準化比值(international normalized ratio, INR )恢復正常水平,肝功能和腹水有所好轉。Garg等[29]亦發現BM-MSC可以明顯降低ACLF患者的肝功能評分(包括Child-Pugh、MELD和SOFA評分)。有研究[30]將自體BM-MSC在體外誘導分化為HLC后回輸入體內,隨訪6個月后發現移植組患者的下肢水腫和腹水明顯改善。Peng等[31]將自體BM-MSC從肝動脈輸入HBV相關肝衰竭患者體內,48周后觀察到血清總膽紅素下降,白蛋白升高,MELD評分降低。

一項非盲隨機對照研究[32]旨在探究BM-MSC治療肝衰竭的有效性,共有56例HBV相關ACLF患者接受注射同種異體的BM-MSC[(1～10)×105個/kg],每周1次,連續4周,隨訪24周后發現患者血清總膽紅素水平、MELD評分改善,移植組的嚴重感染發生率較對照組顯著下降(16.1% vs 33.3%,P=0.04),24周累積生存率移植組顯著高于對照組(73.2% vs 55.6%,P=0.03)。這至少表明同種異體BM-MSC在短期內可以改善肝衰竭患者的肝功能,且安全性較好。

還有研究者[33]將UC-MSC由肝動脈注入11例HBV相關ACLF患者體內(1×108個/次),4周后發現血清中白蛋白、轉氨酶、膽紅素、INR水平和MELD評分較前改善,繼續隨訪24個月,未觀察到和輸注相關的嚴重不良事件的發生。

3.2 干細胞治療病毒性肝炎引起的失代償期肝硬化

BM-MSC治療病毒引起的失代償肝硬化患者具有不錯的安全性和效果。Xu等[11]將乙型肝炎肝硬化失代償期患者的自體BM-MSC經肝動脈輸入體內,隨訪24周,移植組20例完成隨訪,對照組19例完成隨訪。結果顯示移植組的肝功能、MELD評分顯著優于對照組。除乙型肝炎引起的失代償肝硬化外,有研究[34]提示MSC治療由HCV引起的肝硬化同樣可以降低患者的Child-Pugh評分和MELD評分,同時發現MSC的注射途徑和是否分化為HLC并不影響整體治療效果。但并非所有BM-MSC移植后都呈現滿意的療效。Mohamadnejad等[35]的研究納入了27例肝硬化失代償期患者,15例從外周血注射自體BM-MSC,剩余對象注射生理鹽水作為對照。1年后兩組間肝功能評分和INR無明顯差異,該結果不排除和注射途徑、BM-MSC的質量有關。

G-CSF動員后的干細胞同樣可以改善失代償肝硬化患者的病情。Guo等[36]利用G-CSF先將失代償期肝硬化患者的CD34+BMSC動員至外周血,之后富集外周血中的干細胞并由肝動脈回輸至肝臟,發現富集后回輸組的治療效果優于單純G-CSF動員組。之后約10年的隨訪結果顯示,患者血清白蛋白、膽堿酯酶水平提高,凝血功能改善,MELD評分下降,平均生存期由71個月延長至94個月,5年生存率由52.1%升高至71.2%。 Khan等[37]針對HBV和HCV引起的肝硬化患者,從肝動脈注入G-CSF動員后的BM-MSC,6個月后結果提示白蛋白升高,轉氨酶和膽紅素下降,Child-Pugh評分改善。國外其他類似的研究[38-39]也發現患者移植經過或未經過動員的BMSC后未出現嚴重不良反應,肝功能血清學指標好轉,肝功能評分明顯下降,患者的臨床癥狀和相關并發癥得到緩解。G-SCF動員后,不管被移植入的是BM-MSC還是BMSC,患者都表現出了不錯的耐受性,肝功能明顯好轉,肝臟再生活動基因表達上調[40]。在由肝動脈注射BM-MSC的研究中,HBV相關的肝硬化患者6個月的Child-Pugh評分遠低于對照組[41]。

Zhang等[42]的研究將UC-MSC從外周靜脈注入乙型肝炎相關失代償期肝硬化患者體內,48周后發現患者腹水減少,肝功能和MELD評分均改善。同樣的治療方法在乙型肝炎相關ACLF患者中得到相同的結論[43]。Lin等[44]的研究探討了UC-MSC治療在肝硬化患者中的安全性,在移植干細胞后不同時段監測血清中血糖、總膽固醇、尿素氮、甲胎蛋白、白細胞數和凝血酶原活動度,結果表明很少有患者發生致瘤或其他嚴重不良反應,且UC-MSC治療對上述血清學指標影響微乎其微,表明UC-MSC可以提高患者的生存質量,安全性值得肯定。該團隊還對HBV相關的肝硬化失代償患者作了長達7年的預后隨訪研究,219例患者分為UC-MSC處理組108例和對照組111例,處理組共接受了3次MSC注射,每次間隔4周。結果顯示,在13～75個月的總體生存率處理組高于對照組,但肝細胞癌患病率兩組之間并無顯著差異;48周內處理組的白蛋白、總膽紅素、膽堿酯酶和凝血酶原活動度明顯改善,且未出現治療相關的并發癥,結果表明UC-MSC在改善HBV相關肝硬化患者的長期生存率方面也有積極的作用[45]。

3.3 干細胞治療其他原因引起的失代償期肝硬化 BM-MSC可以減輕酒精性肝硬化患者的肝纖維化程度。有研究應用自體BM-MSC治療酒精性肝硬化失代償期患者,結果顯示除肝功能和評分改善外,肝纖維化相關蛋白,如Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1等表達減少,肝臟病理也提示肝臟結構有所恢復,輸注2次后肝臟組織膠原含量減少了37%[46],Jang等[47]的類似研究結果也提示患者肝組織學改善。Pai等[48]在酒精性肝硬化人群中應用BM-MSC治療后觀察到膽紅素、轉氨酶水平降低,Child-Pugh評分下降,以及腹水減少。這充分說明了自體干細胞治療失代償期肝硬化患者的有效性。

隨著對干細胞治療機制的認識加深,其免疫調節功能被越來越多應用于治療某些自身免疫性疾病。在自身免疫性肝病患者中應用G-CSF動員后的CD34+BMSC治療,患者肝功能指標可以恢復正常[28];某些自身免疫性疾病(如類風濕性關節炎、原發性干燥綜合征等)引起的肝硬化患者移植UC-MSC后表現出了良好的耐受性,隨訪2年間肝功能逐步恢復[49]。針對原發性膽汁性膽管炎(PBC)患者的兩項干細胞治療的臨床研究[50]結果顯示,移植BM-MSC和UC-MSC后,患者肝功能的血清學指標顯著改善,包括轉氨酶、γ-谷氨酰轉移酶和堿性磷酸酶等,同時IL-10、CD4+/CD25+T淋巴細胞水平都有所上升。但對于免疫性疾病導致的失代償期肝硬化,個別利用干細胞治療案例出現了很嚴重的后果。有研究[51]利用BM-MSC治療PBC和自身免疫性肝炎(AIH)導致的肝硬化患者各1例,結果雖然顯示肝功能得到了好轉,但患者出現了腎衰竭及其他并發癥。該團隊之后用骨髓干細胞由外周靜脈輸入2例PBC和4例AIH患者體內治療,患者的肝功能并未好轉甚至出現了2例死亡[36]。以上結果提示利用干細胞治療免疫相關ESLD還需謹慎。

最后,針對其他原因(如藥物性肝炎、遺傳性肝病、特發性肝病等)導致的ESLD,干細胞療法亦有可喜的成效。通過將自體BM-MSC或G-CSF動員后的干細胞直接經肝臟注射治療后,患者未出現明顯不良反應,肝功能和相關評分均得到改善[52]。對于非病毒性肝炎引起的肝硬化失代償期患者而言,自體BM-MSC移植后血清白蛋白水平和MELD評分改善顯著[53]。而對BM-MSC-Exo的治療作用仍處在基礎研究階段,暫時沒有相關臨床研究報道。

4 干細胞治療ESLD的問題

盡管干細胞治療ESLD取得了不錯的成果,細胞治療肝病是一條新的極有前景的道路,但仍有太多問題亟待解決。

4.1 干細胞轉分化為HLC及肝臟歸巢機制不明 干細胞治療機制不明一定程度上是由于缺乏對移植細胞的有效定位手段,無法得知干細胞肝臟歸巢及向HLC詳細轉化的過程。此外,長期培養MSC會降低其分化能力[54]。由于BM-MSC在肝臟受損時會自發向肝臟歸巢,如果清楚其歸巢的條件及促進肝臟內源性再生的機制就能避免BM-MSC移植的弊端,這是今后極具挑戰和富有意義的研究方向。

4.2 干細胞移植的安全性無法完全保證 2019年的一項評估MSC致瘤性的研究[55]并未發現對照組和BM-MSC輸注組腫瘤發病率存在差異,但之前有研究[56]觀察到BM-MSC在體外培養時會發生染色體畸變。除致瘤可能導致移植風險外,由于干細胞移植是有創操作,在此過程中就存在傳播病毒的風險,如巨細胞病毒、單純皰疹病毒和細小病毒B19等。

4.3 不同來源干細胞質量無法保證 每種來源的干細胞都有各自的優勢和不足,如何選擇哪種干細胞適合用作移植?首先要建立一套統一的干細胞質量評價體系。其次,如何通過對干細胞預處理來優化待移植干細胞的總體質量?有必要對干細胞的分離鈍化流程進行標準化,并借用相關技術來提升干細胞活性,如基因編輯、G-CSF動員或選用相關細胞因子誘導,這些都有賴于基礎實驗的突破來為臨床提供正確的指導。

4.4 干細胞使用缺乏標準化導致臨床研究質量參差不齊 干細胞在臨床試驗中的使用未經標準化,包括適應證和禁忌證、最佳注射途徑、注射劑量、注射次數等。從現有的臨床研究中總結來看:納入對象包括各種病因引起的ESLD,缺乏同質性;單次注射干細胞數量跨度太大,范圍在105～109,部分研究按體質量計算單次注射量;隨訪時間多為2～12個月;輸注途徑主要有外周靜脈和肝臟注射(肝動脈或門靜脈),部分研究通過脾臟注射。相關動物研究[57]提示由外周靜脈輸注的MSC相當一部分都滯留在肺部,遠不如由門靜脈注射的療效好。而通過門靜脈和肝動脈輸注干細胞的歸巢效率分別為小于5%和20%～30%,所以可能肝動脈是最佳的輸注途徑[58],但也有研究[29]顯示不同注射方式之間的療效沒有顯著差異。以上現象導致大多數的臨床實驗質量參差不齊,難以獲得足夠的高質量研究得出可靠的結論。同時,缺乏橫向對比,如探究不同注射方式、注射劑量的療效有無差別,且其長期療效缺乏足夠的臨床事實肯定。

5 展望

當前,肝移植是治愈ELSD的唯一手段,但由于肝源缺乏等問題導致等待肝移植患者的死亡率逐年升高。在此形勢下,眾多的臨床研究結果表明,干細胞治療已經展現出了極大的潛力。其中,關于MSC的研究最多,大多數結果均肯定了其短期改善肝功能的療效,表現為肝臟血清學指標的改善、臨床癥狀的緩解、肝臟相關評分的好轉、肝臟病理表現有所恢復,且很少發現和其相關的嚴重不良反應。UC-MSC在HBV相關肝硬化人群中的長期療效已經得到證實,但其他種類的干細胞在各類ELSD患者中的長期療效還未有充足的臨床證據;對于少數由于注射干細胞出現的不良事件,提示未來需要更加謹慎地評估相關人群的干細胞治療條件。這不僅依賴于臨床研究中對MSC使用過程進行標準化來增加研究結論的可靠性,還需基礎實驗領域對MSC治療肝病的作用機制研究有進一步的突破,包括體內歸巢、實現抗纖維化和免疫調節的具體通路和調控方式。

目前關于BM-MSC的研究主要集中在如何提高其治療ESLD的效果,可以增加MSC本身的數量或功能,包括用細胞因子對MSC預處理,或進行基因編輯、富集分選等。值得一提的是,有學者[59]發現某些中藥可以增強BM-MSC的分化能力,相比于其他處理手段更加安全和廉價,有望成為MSC移植的潛在輔助手段。相比之下,Exo由于體積更小,更易獲取,膜蛋白數量更少所以免疫排斥性要小于BM-MSC;且其本身為膜結構,致瘤可能性比MSC更小,安全性更高;還可以直接跨膜傳遞信息,調控損傷肝細胞的修復和再生過程,是非常好的藥物治療載體,所以通過提高MSC-Exo的分泌數量達到可觀的治療效果是今后針對ELSD極有前景的治療方法之一。目前已有一些方法可以提高Exo的分泌數量,如正切流動過濾法(tangential flow filtration, TFF)可以比單純的超速離心大大增加Exo的數量,超聲降解更是可以將其產量提高到20倍[60],還有3D培養、利用特殊介質如海藻酸水凝膠對MSC進行培養等[61]。早在2015年我國就頒布了《干細胞臨床研究管理辦法(試行)》[62],在制度的規范下,還需開展大規模的多中心臨床隨訪研究保證其用于人體的安全性和有效性,相信不遠的未來干細胞治療會給更多的ESLD患者帶來福音。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：林炳亮提出研究選題,設計研究方案;馮宇負責調研整理文獻、撰寫論文;陳俊峰、林炳亮提供指導性支持及修訂、終審論文。